三氯乙烯和四氯乙烯的細胞毒性及氧化應激機制研究

逯南南，許燕，趙清華，孫莉，石近淼，王明泉，孫韶華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質監測中心，濟南 250021

氯乙烯類有機物廣泛用于工業、醫療、日用品等領域，隨著其生產和使用量的增長，已成為重要的環境污染物之一，在空氣、水、土壤中均能檢測到氯乙烯類污染物[1-5]，詳見表1。三氯乙烯(TCE)和四氯乙烯(PCE)是易揮發的不飽和脂肪組氯代烴，美國環保署(EPA)將三氯乙烯定性為人類致癌物，國際癌癥研究中心(IARC)將三氯乙烯和四氯乙烯分別定義為I類和2A類致癌物[6-7]。鑒于TCE和PCE環境污染的普遍性、對人類的危害性及其治理的復雜性，其生物毒性研究已成為國內外學者廣泛關注的問題。離體細胞測試技術由于其簡便、快捷已被廣泛應用于污染物的生物毒性評價中。TCE和PCE暴露被證實與職業性剝脫性皮炎、重癥多形紅斑、大皰性表皮壞死松解癥和多形紅斑等疾病有關[8-9]，因此目前關于TCE和PCE的細胞毒性研究主要以皮膚角質細胞為主，其他體細胞的毒性研究相對較少。本研究以中國倉鼠卵巢細胞為受試細胞，利用離體細胞測試技術開展三氯乙烯和四氯乙烯脅迫下細胞毒性和氧化應激機制研究，為揭示其毒性作用提供理論依據，也為環境污染物安全性評價方法提供支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary, CHO)購自國家細胞資源共享平臺，使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，5% CO2的培養箱中37 ℃條件下培養。

試驗中所用乳酸脫氫酶測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒、過氧化氫酶測定試劑盒、總蛋白定量測試盒以及活性氧測試盒等購自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為色譜純及以上。

1.2 方法

1.2.1 細胞毒性測定

采樣MTT法進行細胞毒性測定，調整細胞濃度為0.5～1×104個·mL-1，接種100L細胞懸液于96孔培養板上培養24 h后，加入三氯乙烯和四氯乙烯進行染毒，設置劑量組分別為50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、500 mg·L-1、1 000 mg·L-1、2 000 mg·L-1，每組設6個平行，同時設置空白對照孔(加入相同體積的培養基)和溶劑對照孔(加入相同體積的二甲基亞砜)。染毒24 h后棄掉原培養液，每孔加入新鮮培養100L及50L 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液，繼續培養4 h，棄培養液，加入150L 二甲基亞砜(DMSO)溶液，振蕩15 min后，在酶標儀上測定570 nm下的吸光值(OD值)。細胞存活率按下列公式計算：細胞存活率=(實驗組OD值對照組OD值)100%，用細胞存活率-染毒濃度作圖法求出半數抑制濃度IC50。

1.2.2 酶活性的測定

細胞接種及培養方法同1.2.1。在IC50值以下設置濃度進行三氯乙烯和四氯乙烯進行染毒，劑量分別為20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1，染毒試驗24 h后測定細胞培養液中乳酸脫氫酶(LDH)活性和細胞內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，測定過程按照試劑盒說明書進行。用含1% DMSO的培養液作溶劑對照組，以染毒組細胞培養液中的LDH含量與對照組的比值反映細胞毒性。每個濃度做6個重復孔。

1.2.3 活性氧的定性觀察

2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)可以自由穿過細胞膜進入細胞，在細胞內可被酯酶水解而生成2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH)。DCFH不能透過細胞膜，其在細胞內可被活性氧(ROS)氧化為有熒光的2',7'-二氯熒光素(DCF)，故檢測DCFH的熒光強度可代表細胞內ROS的水平。細胞培養及接種方法同1.2.1。在IC50值以下設置濃度進行三氯乙烯和四氯乙烯進行染毒，劑量分別為20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1，染毒試驗24 h后，加入DCFH-DA 37 ℃孵育細胞60 min，胰蛋白酶消化、離心收集細胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2～3次并重懸細胞，熒光顯微鏡下觀察。以活性氧供氫體(H2O2)為陽性對照。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 三氯乙烯和四氯乙烯的細胞毒性

倒置顯微鏡下觀察對照組細胞貼壁良好，細胞呈梭形或多角形，形態完整分布均勻；而高濃度TCE和PCE染毒24 h后細胞變形，貼壁率下降，密度明顯減少，培養液中出現大量死亡細胞漂浮(圖1)；MTT實驗結果顯示TCE和PCE暴露能夠抑制CHO細胞的生長，隨著染毒濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，存在明顯的劑量-效應關系。與對照組相比，TCE 100 mg·L-1及以上和PCE 50 mg·L-1及以上試驗組細胞存活率顯著下降(P<0.05)。通過對數擬合計算得到兩者對CHO細胞24 h的IC50分別為590 mg·L-1、281 mg·L-1(圖2)。

2.2 三氯乙烯和四氯乙烯對細胞膜的損傷

與空白對照組相比，溶劑對照組細胞培養液中總LDH活性沒有明顯變化，說明使用DMSO作為助溶劑對TCE和PCE的細胞毒性作用沒有顯著影響。TCE和PCE暴露均導致體外培養的CHO細胞LDH釋放水平增加，隨著染毒濃度的增大，細胞培養液中LDH的活性不斷增大，表明細胞膜受損程度越大。通過方差分析發現，與溶劑對照組相比，TCE染毒濃度50 mg·L-1及以上，PCE染毒濃度20 mg·L-1及以上試驗組細胞培養液中LDH活性變化顯著。

圖1 TCE和PCE對CHO細胞形態的影響(100倍)Fig. 1 Effects of TCE and PCE on cells morphology (×100)

圖2 TCE和PCE對CHO細胞存活率的影響Fig. 2 Effects of TCE and PCE on cell viability

圖3 TCE和PCE對CHO細胞內ROS產生的影響(100倍)Fig. 3 ROS production in CHO cells exposed to TCE and PCE (×100)

2.3 三氯乙烯和四氯乙烯對細胞的氧化損傷

對照組細胞內產生很少熒光，而經TCE和PCE染毒后的細胞，細胞內熒光強度明顯增加，且熒光強度的產生與染毒物的劑量存在相關性，高劑量組的熒光強度明顯高于低劑量組。同劑量組的TCE染毒組細胞內的熒光強度強于PCE染毒組，說明TCE誘導細胞產生ROS的能力更強(見圖3)，各實驗組細胞密度的比較見圖4。

細胞培養至24 h后，與空白對照組相比，溶劑對照組SOD、CAT活性無顯著差異。TCE和PCE染毒組細胞內SOD酶活性均有下降趨勢，且200 mg·L-1染毒組酶活性下降顯著；20 mg·L-1、50 mg·L-1染毒組細胞CAT酶活性有升高趨勢，且PCE 50 mg·L-1染毒組酶活性顯著升高，說明較低的污染物濃度能夠激活CAT的活性，隨著染毒濃度的升高，CAT的活性逐漸下降，200 mg·L-1PCE染毒組CAT酶活性受到顯著抑制(圖5)。

3 討論(Discussion)

TCE和PCE的用途廣泛決定了它們的大量生產，由于生產、使用、儲存或處置不當等一些原因，使其通過揮發、泄露、廢水排放、農藥使用及含氯有機物成品的燃燒等途徑進入大氣、土壤、地下水中[10-14]，對人類健康和環境造成較大危害。近年來，國內外學者針對此類污染物的肝臟、中樞和末梢神經系統、腎臟、肺、心臟毒性等做了大量研究。其中離體細胞毒性檢測技術因簡便、快速而成為一種常用的毒性評價手段。關于氯乙烯類污染物對體外培養肺源細胞和皮膚膠質細胞等類型細胞的毒性已有相關報道，如王波等[15]采用MTT測試技術得到TCE對體外培養中國倉鼠肺細胞的IC50值為368 mg·L-1；沈彤等[16]和丁銳等[17]的研究顯示TCE和PCE對體外培養人皮膚角質形成細胞中性紅半數抑制濃度分別為4.53 mmol·L-1(595 mg·L-1)和2.16 mmol·L-1(358 mg·L-1)。本研究顯示TCE和PCE對中國倉鼠卵巢細胞24 h的IC50值分別為590 mg·L-1、280 mg·L-1，與前期研究結果類似。

表2 各劑量組TCE和PCE染毒后細胞培養液中乳酸脫氫酶(LDH)與空白對照組的比值(%，x±s)Table 2 The ratios of lactate dehydrogenase (LDH) between TCE or PCE exposure groups and the control group (%, x±s)

注：* 與溶劑對照組比較，P<0.05。

Note: * represents a significant difference between exposed group and solvent control group,P<0.05.

圖4 TCE和PCE對CHO細胞密度的影響(100倍)Fig. 4 Cell density of CHO exposed to TCE and PCE (×100)

圖5 TCE和PCE對CHO細胞內SOD和CAT酶活性的影響Fig. 5 The effects of TCE and PCE on SOD and CAT activities in CHO cells

外源性化合物進入生物體內，經代謝活化可產生各種類型的活性氧自由基，對大多數細胞具有毒性作用。ROS是氧的某些代謝產物及其衍生物質，它們具有比氧活潑的化學性質，統稱為活性氧，主要包括超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫、脂類過氧化物以及單線態氧等。正常條件下，自由基的產生與清除處于平衡狀態，促氧化水平的升高或者抗氧化能力的減弱都會導致體內ROS含量的升高，使機體處于氧化應激狀態，脂質過氧化作用增強，引起細胞膜結構、通透性改變、細胞免疫功能下降或者DNA鏈斷裂等[18-19]。TCE和PCE暴露條件下，細胞內ROS含量明顯上升，胞內能量代謝和抗氧化過程中一些關鍵酶的活性也受到影響。

LDH是細胞能量代謝過程中的關鍵性酶，如果細胞膜損傷破裂，LDH便會從胞漿中釋放出來進入細胞培養液中，因此培養液LDH的活性可用于表征細胞膜的損傷程度。Lash等[20]使用0.2、0.5、1.0 mmol·L-1的PCE對體外培養的雄性大鼠腎臟皮質細胞進行染毒，發現作用3 h后各濃度組與溶劑對照組間LDH釋放情況均有顯著性差異。丁銳等[21]研究發現三氯乙烯可以引起體外培養的皮膚角質形成細胞膜損傷，接觸三氯乙烯時間越長、濃度越高，細胞膜損傷越嚴重。本研究得到的結果與相關報道吻合。

抗氧化酶能清除在細胞內生成的活性氧，構成對活性氧的防御體系。SOD和CAT是生物體內抗氧化系統中關鍵性酶能將超氧陰離子自由基分解為過氧化氫和水，之后CAT將過氧化氫分解為完全無害的水。丁銳等[21]研究TCE和PCE對體外培養人皮膚角質形成細胞脂質過氧化的影響時發現，TCE和PCE染毒組細胞內ROS水平隨TCE和PCE濃度增加呈上升趨勢，而SOD酶活性呈下降趨勢，與溶劑對照組相比較差異有顯著性，且存在劑量效應關系。CAT酶活性在低濃度組呈激活態勢，而隨著污染物濃度的升高而活性受到抑制。Lowry等[22]和Chen等[23]研究也證實了TCE和PCE可導致機體發生氧化損傷作用。本研究發現TCE和PCE染毒組細胞內ROS水平顯著上升，而SOD和CAT酶活性的下降使得自由基清除能力減弱，進一步加劇了活性氧的積累。ROS的不斷積累引發細胞內氧化應激的發生。