2種類型多壁碳納米管對蛋白核小球藻的毒理研究

羅瀟宇，任垠安，高浩杰，高恩光，王應軍,*

1. 四川農業大學環境學院，成都 611130 2. 四川雅安經濟開發區規劃建設和安全生產環境保護局，雅安 612500

納米技術已在許多領域得以應用。與此同時，納米材料通過生產、水處理應用和其他商品使用等途徑直接或間接進入到水環境中，可能會對一些水生生物造成危害。ZnO、CuO和TiO2等納米材料對藻類的光合作用影響顯著，能改變藻細胞內葉綠素含量或干擾光合作用過程中光電子轉運[1]。多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs)作為納米技術產品之一，由于其出色的性能，諸如：優異的導電性、高抗拉強度、巨大的表面積以及半導體和吸附潛力，使得它在環境保護方面也有一定的應用[2-3]。Mueller等[4]預測世界范圍內碳納米管產量在每年350～500噸水平。隨著需求的增加，碳納米管大規模的商業化生產和應用引起了人們關于這些納米材料對環境和人體潛在影響的擔憂[5]。盡管納米材料的環境濃度已經有模型研究預測，但關于納米材料的實際環境濃度大部分還是未知的[4]。例如，碳納米管的釋放將導致納克和毫克水平的環境濃度[4]，碳納米管在水生環境中的濃度級通常估計為ng·L-1[6]。雖然對實際環境濃度的了解相對較少，但研究者們對碳納米管的潛在毒性和環境影響還是予以了一定關注。

研究表明單壁碳納米管不僅可導致大鼠肺部組織損傷和肉芽腫的形成[7-8]，還可引起小鼠肝臟組織蛋白質的氧化損傷和大鼠主動脈內皮細胞損傷[9-10]。還有研究指出在純培養條件下，納米材料具有抗菌性[11-14]。納米二氧化鈰在低濃度(≤80 mg·L-1)時可促進蛋白核小球藻的生長及光合色素及可溶性性蛋白質的合成，但在高濃度(>80 mg·L-1)時對蛋白核小球藻具有毒性效應[15]。碳納米材料往往通過靜電、氧化或細胞膜穿刺等作用產生效應，特別是通過產生活性氧或氮物質產生氧化作用，這均需要緊密接觸才會破壞細胞膜[16]。在水體環境中，水底沉積物中高濃度水平的MWCNTs對無脊椎動物多樣性無影響，在3個月的暴露時間里，無脊椎動物的數量增加。相比之下，經過15個月的暴露，檢測結果表明2 mg·L-1的MWCNTs對沉積物中的群落結構有著顯著影響[17]。未純化和氧化處理的MWCNTs在實驗室條件下對普通小球藻均有劑量效應關系：未純化MWCNTs的IC50值為(5.5±1.8) mg·L-1，氧化MWCNTs的IC50值為(6.9±1.9) mg·L-1，且它們的毒性效應主要來自MWCNTs的團聚遮光效應[18]。研究者通過“超聲懸浮”和“普通攪拌”2種方式對雙壁碳納米管進行實驗處理，結果顯示采用“超聲懸浮”的雙壁碳納米管對假微型海鏈藻和骨藻具有更大的毒性，表明雙壁碳納米管在水環境中的生物毒性與它們的分散狀態有關[19]。在光照條件下，單璧碳納米管在純水中可以產生活性氧自由基[20]。活性氧自由基可增加氧化壓力，導致細胞膜質過氧化、破壞細胞結構或導致酶活性異常，最終導致細胞凋亡。因此，碳納米管導致的氧化脅迫也可能是碳納米管致毒機理的一部分。

藻類作為水體中的一種初級生產者，對水生生態系統的穩定具有重要作用。水環境中的許多水溶性污染物可通過食物鏈進入人體，對人體健康造成影響[21]。由于小球藻細胞小，結構簡單，在環境中暴露得較為全面，所以學者們將小球藻應用于重金屬的毒性研究，通過暴露實驗，從小球藻某些生理指標來衡量重金屬毒性[22]。

本文通過研究原始多壁碳納米管(original multi-walled carbon nanotubes, P-MWCNTs)及羥基化多壁碳納米管(hydroxylated multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs-OH)對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)葉綠素a含量、比生長速率μ、可溶性蛋白質含量、總抗氧化能力值(total antioxidant capacity, T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的影響，探究原始多壁碳納米管及羥基化多壁碳納米管對蛋白核小球藻毒性效應機制，為評估2種類型多壁碳納米管對藻類的生物學效應及其環境風險積累提供一定的數據資料和科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

蛋白核小球藻(FACHB-5)購自中國科學院野生生物種質庫——淡水藻種庫。在超凈臺中，將藻種轉接到滅菌之后的BG11培養基中，在25 ℃、光照度3 000～4 000 lux、光周期12 h Light/12 h Dark的光照培養箱(RXZ型智能人工氣候箱，寧波，江南儀器廠)中，每天定時搖瓶3次培養。BG11培養基配方如Wu等[23]在其文獻中所述。

P-MWCNTs的物化參數為：納米管外徑(OD)10～20 nm，內徑(ID)5～10 nm，納米管長度(length) 10～30 μm，比表面積(SSA)>150 m2·g-1，純度>98wt%；MWCNTs-OH的物化參數為：OD 10～20 nm，ID 5～10 nm，length 10～30 μm，SSA>170 m2·g-1，純度>98wt%。二者購自中科時代納米成都有機化學有限公司。將定量的P-MWCNTs和MWCNTs-OH分散到BG11培養基中，配成4 mg·L-1的母液，再滅菌待用。由于P-MWCNTs和MWCNTs-OH均不溶于水，水系中分散性不佳，在水中靜置會沉至容器底部，實驗使用前置于超聲波清洗機(KQ5200DE型數控超聲波清洗機，200 W、40 kHz，昆山超聲儀器有限公司)超聲20 min，使得2種類型的MWCNTs分散液更為均勻。可溶性蛋白質、T-AOC和MDA試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 MWCNTs表征

P-MWCNTs和MWCNTs-OH結構表征前在100 ℃烘箱中干燥24 h。熱重分析(TGA)研究材料的熱穩定性，掃描電鏡(SEM)表征碳納米管的微觀形貌結構。

1.2.2 藻種的擴大培養

取處于對數增長期的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，在無菌條件下轉接到BG11培養基中，于上述藻培養條件下活化7 d，再進一步擴大培養以滿足實驗需求。

1.2.3 暴露實驗

本文參照OECD201藻類生長抑制實驗方法，將蛋白核小球藻接種在滅菌后的三角錐形瓶中，其初始藻接種藻密度為1 000 000 cells·mL-1，再分別加入定量P-MWCNTs和MWCNTs-OH母液，使最終實驗濃度為0、5、10、20、40、80 mg·L-1，在光照度3 000～4 000 lux、光周期12 h Light/12 h Dark的光照培養箱中暴露96 h。每組實驗設3個平行。

1.2.4 比生長速率的測定

自實驗接種之日起，每隔24 h取樣，用血球計數板在顯微鏡下測定藻細胞密度N(cells·mL-1)。利用如下公式計算比生長速率μ。

式中：μ—為比生長速率(d-1)；Nt—T時刻的藻細胞密度(cells·mL-1)；N0—初始藻細胞密度(cells·mL-1)；T—暴露時間(d)。

1.2.5 葉綠素a的測定

在實驗室條件下，葉綠素a與生物量呈顯著正相關關系[24]。從0 h到96 h每天定時取5 mL藻液，8 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入5 mL 90%丙酮(V/V)，搖勻，放入冰箱，4 ℃避光萃取24 h以提取蛋白核小球藻細胞中的葉綠素a；把萃取過后的葉綠素a提取液置于高速離心機中，10 000 r·min-1離心10 min取上清液，以90%丙酮作為參比，置于分光光度計中測定上清液在波長分別為630 nm、645 nm、663 nm和750 nm時的吸光度。葉綠a含量采用周永欣等[25]的方法計算：

C=11.64×A663-A750-2.16×A645-A750+0.10×A630-A750

式中：C—樣品葉綠素含量(μg·mL-1)；V1—提取液體積(mL)；V2—藻液體積(mL)；N—藻細胞密度(cells·mL-1)。

1.2.6 可溶性蛋白質、T-AOC和MDA含量的測定

在實驗第96小時分別取每個錐形瓶中藻液40 mL，4 500 r·min-1離心10 min，棄上清液，用5 mL生理鹽水懸浮洗滌2～3次以除去附著在蛋白核小球藻表面的培養基，再離心，之后就可得到藻細胞。然后把藻細胞轉移至研缽中，加入2 mL預冷的生理鹽水和少量的石英砂進行冰浴研磨，直到鏡檢無完整藻細胞為止，定容到10 mL，4 ℃下5 000 r·min-1離心10 min，上清液即為樣本提取粗酶液。可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[26]，T-AOC測定采用鐵離子還原能力法(FRAP法)[27]，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法(TBA法)[26]。

圖1 多壁碳納米管(MWCNTs)TGA和SEM表征圖注：TGA為熱重分析；DTA為差熱分析法；SEM表示掃描電子顯微鏡。1-1和1-2為原始多壁碳納米管(P-MWCNTs)的TGA和SEM的表征圖； 1-3和1-4為羥基化多壁碳納米管(MWCNTs-OH)的TGA和SEM的表征圖。Fig. 1 The TGA curve and SEM image of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs)Note: TGA stands for thermogravimetric analysis; DTA stands for differential thermal analysis; SEM stands for scanning electron microscope. Figure 1-1 and figure 1-2 show the TGA curve and SEM image of original multi-walled carbon nanotubes (P-MWCNTs); figure 1-3 and figure 1-4 show the TGA curve and SEM image of hydroxylated multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs-OH).

1.3 數據分析

采用SPSS 22.0對數據進行方差分析及t檢驗，P<0.05表示有顯著性差異，用*表示。采用Origin進行圖表繪制。

2 結果(Results)

2.1 MWCNTs表征

P-MWCNTs的TGA和SEM表征圖分別如圖1-1和圖1-2所示，MWCNTs-OH的TGA和SEM表征圖分別如圖1-3和圖1-4所示。對比表征圖可知MWCNTs-OH被截斷，管體破裂并且開口。樣品表面光滑，分散性提高，一部分碳管直徑變厚。P-MWCNTs和MWCNTs-OH的結構和性質穩定。

2.2 MWCNTs對蛋白核小球藻生長的影響

圖2-1和圖2-2分別顯示了蛋白核小球藻在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露下其比生長速率變化情況。由圖2-1可知，與對照組相比，P-MWCNTs濃度分別為5 mg·L-1和10 mg·L-1實驗組的生長趨勢一致，它們的比生長速率都是在72 h達到最大，96 h后，蛋白核小球藻的生長都會有所減緩。當P-MWCNTs濃度達到20 mg·L-1時，蛋白核小球藻的生長受到抑制，這種抑制現象也出現在更高P-MWCNTs濃度的實驗組。最小比生長速率(-0.91 d-1)出現在暴露于80 mg·L-1P-MWCNTs 24 h后的實驗組，這表明80 mg·L-1的P-MWCNTs能對蛋白核小球藻的生長產生明顯的抑制作用。由圖2-2可知，與對照組相比，MWCNTs-OH濃度分別為5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1實驗組的生長趨勢一致，它們的比生長速率都是先增加再減小，實驗96 h后比生長速率又增大，但小于48 h比生長速率。當MWCNTs-OH濃度分別達到40 mg·L-1和80 mg·L-1時，蛋白核小球藻的生長從24 h逐漸受到抑制，且隨著實驗時間的延長，蛋白核小球藻的比生長速率越來越小。最小比生長速率(-0.43 d-1)出現在暴露于80 mg·L-1MWCNTs-OH 96 h后的實驗組，這表明80 mg·L-1的MWCNTs-OH亦能對蛋白核小球藻的生長產生明顯的抑制作用，且這種抑制作用隨著時間的延長而加強。

圖2 不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH對蛋白核小球藻生長的影響注：*表示與對照組相比，P<0.05。Fig. 2 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the growth of Chlorella pyrenoidosaNote: compared with the control, *P<0.05.

圖3 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響Fig. 3 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the content of chlorophyll a in Chlorella pyrenoidosa

2.3 MWCNTs對蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響

圖3-1和圖3-2分別顯示了蛋白核小球藻在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露下葉綠素a含量的變化情況。由圖3-1可知，暴露在P-MWCNTs 24 h后，與對照組相比，P-MWCNTs的所有實驗組蛋白核小球藻葉綠素a含量都低于對照組，P-MWCNTs濃度范圍為0～10 mg·L-1實驗組在實驗48 h內葉綠素a含量均有所增長且較為平緩，48 h后，濃度范圍0～10 mg·L-1實驗組葉綠素a含量增長速率增大，而濃度范圍為20～80 mg·L-1實驗組的葉綠素a含量從實驗一開始就維持在較低水平，與對照組差異顯著(P<0.05)，且組間差異不顯著(P> 0.05)。總的來說，蛋白核小球藻葉綠素a含量呈隨著P-MWCNTs濃度增加而降低的趨勢，當P-MWCNTs濃度≥20 mg·L-1時，蛋白核小球藻葉綠素a含量一直減少。由圖3-2可知，暴露在MWCNTs-OH 24 h后，與對照組相比，MWCNTs-OH的所有實驗組蛋白核小球藻葉綠素a含量都低于對照組，濃度范圍為0～10 mg·L-1實驗組在實驗24 h內葉綠素a含量均有所增長且較為平緩，24 h后，0～20 mg·L-1實驗組葉綠素a含量增長速率增大，48 h后，0～20 mg·L-1實驗組葉綠素a含量增長速率又減小，而MWCNTs-OH濃度范圍為40～80 mg·L-1實驗組的葉綠素a含量從實驗一開始也維持在較低水平，與對照組差異顯著(P<0.05)，且組間差異亦不顯著(P>0.05)。總的來說，蛋白核小球藻葉綠素a含量呈隨著MWCNTs-OH濃度增加而降低的趨勢，當MWCNTs-OH濃度≥40 mg·L-1時，蛋白核小球藻葉綠素a含量一直減少。

2.4 MWCNTs對蛋白核小球藻可溶性蛋白質含量的影響

圖4顯示了蛋白核小球藻分別在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH脅迫96 h后可溶性蛋白質含量的變化情況。由圖4可知，蛋白核小球藻可溶性蛋白質含量整體隨MWCNTs濃度的增加呈先增加后減少的趨勢。具體而言，當蛋白核小球藻暴露在10 mg·L-1和20 mg·L-1MWCNTs-OH實驗條件下，藻細胞可溶性蛋白質含量相對于對照組有明顯增加(P<0.05)，而蛋白核小球藻暴露在5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1P-MWCNTs實驗條件下，藻細胞可溶性蛋白質含量相對于對照組沒有發生顯著改變(P>0.05)。當蛋白核小球藻分別暴露在濃度為40 mg·L-1和80 mg·L-1P-MWCNTs和MWCNTs-OH實驗條件下，它們的可溶性蛋白質含量明顯低于對照組(P<0.05)。

2.5 MWCNTs對蛋白核小球藻總抗氧化能力值的影響

圖5顯示了蛋白核小球藻分別在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露96 h后總抗氧化能力值(T-AOC)的變化情況。由圖5可知，蛋白核小球藻的T-AOC在2種MWCNTs暴露條件下隨著納米材料暴露濃度的增加而減小。與對照組相比，20 mg·L-1以及更高濃度P-MWCNTs實驗組蛋白核小球藻的T-AOC更小(P<0.05)，而至于MWCNTs-OH實驗組，40 mg·L-1以及更高濃度暴露下的蛋白核小球藻具有更小的T-AOC(P<0.05)。在相同濃度的MWCNTs暴露下，MWCNTs-OHs實驗組的蛋白核小球藻具有比P-MWCNTs實驗組蛋白核小球藻更大的T-AOC。當蛋白核小球藻分別暴露在濃度為5 mg·L-1和10 mg·L-1的2種MWCNTs的實驗條件下，T-AOC變化不顯著(P>0.05)。

圖4 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對蛋白核小球藻可溶性蛋白質含量的影響注：*表示實驗組與對照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 4 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the content of soluble protein in Chlorella pyrenoidosaNote: * indicated that the difference was significant (P< 0.05) between exposure groups and control group.

圖5 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對蛋白核小球藻總抗氧化能力值(T-AOC)的影響注：*表示實驗組與對照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 5 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the total anti-oxidation capacity (T-AOC) value in Chlorella pyrenoidosaNote: * indicated that the difference was significant (P< 0.05) between exposure groups and control group.

2.6 MWCNTs對蛋白核小球藻MDA含量的影響

圖6顯示了蛋白核小球藻分別在不同濃度P-MWCNTs和MWCNTs-OH暴露96 h后MDA含量的變化情況。由圖6可知，蛋白核小球藻細胞MDA含量整體呈隨MWCNTs濃度增大而增加的趨勢。與對照組相比，蛋白核小球藻暴露在20 mg·L-1以及更高濃度P-MWCNTs條件下，其MDA含量開始顯著增加(P<0.05)；而MWCNTs-OH實驗組，40 mg·L-1以及更高濃度實驗組的蛋白核小球藻MDA含量也開始顯著增加(P<0.05)。5 mg·L-1和10 mg·L-1P-MWCNTs以及5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1MWCNTs-OH實驗組蛋白核小球藻的MDA含量與對照組相比沒有發生明顯變化(P>0.05)。

圖6 P-MWCNTs和MWCNTs-OH對蛋白核小球藻 丙二醛(MDA)含量的影響注：*表示實驗組與對照組差異顯著(P<0.05)。Fig. 6 The effects of P-MWCNTs and MWCNTs-OH on the content of malonlydialdehyde (MDA) in Chlorella pyrenoidosaNote: * indicated that the difference was significant (P< 0.05) between exposure groups and control group.

3 討論(Discussion)

盡管目前碳納米管的實際環境濃度并不明確，但是研究者們已經著手碳納米管的環境毒性效應研究[28-29]。本實驗中，蛋白核小球藻暴露在10 mg·L-1及以下濃度P-MWCNTs的條件下，其比生長速率在24～72 h增大，在96 h比生長速率減小，可能是由于藻細胞活性在72 h處最大，在96 h后又變得稍弱。而在實驗室條件下，當P-MWCNTs濃度達到20 mg·L-1時，蛋白核小球藻的比生長速率從24 h開始便為負數，說明抑制作用變得更強。隨著時間的延長，這種抑制作用一直存在。至于這種抑制作用強弱的變化還有待進一步研究。當蛋白核小球藻暴露在濃度≤20 mg·L-1的MWCNTs-OH條件下，其比生長速率先增大、后減小、再增大。總體上，隨著MWCNTs-OH濃度的增加，每個計算時刻的藻細胞比生長速率減小，這可能是因為MWCNTs-OH與藻細胞之間的共沉降作用不穩定導致的，此作用還有待進一步研究。類似的，在實驗室條件下，當MWCNTs-OH濃度達到40 mg·L-1時，蛋白核小球藻的比生長速率從24 h開始便為負數，說明蛋白核小球藻的生長在40 mg·L-1及更高濃度的MWCNTs-OH暴露下，受到了越來越強的抑制，隨著時間的延長，這種抑制作用同樣是一直存在的，且在96 h的抑制作用最強。以上現象表明，2種MWCNTs對蛋白核小球藻的生長抑制作用存在著差異，這可能是因為在制備羥基化多碳納米管時引入了新的官能團，改變了原始多壁碳納米管的結構，引起了性質的差異，導致它們在環境行為的差異。

葉綠素a存在于所有綠色植物體內，是葉綠素重要組成成分之一，它能吸收和轉換光能。同時，葉綠素a在實驗室培養條件下與藻細胞生物量有著顯著的正相關關系[24]。本實驗中，葉綠素a含量可一定程度代表蛋白核小球藻生物量，而且能在一定程度上反映藻細胞在納米材料暴露下光合作用的強弱。當P-MWCNTs濃度低于20 mg·L-1、MWCNTs-OH濃度低于40 mg·L-1時，藻細胞的葉綠素a含量變化明顯。這可能是因為在實驗初期由MWCNTs導致的遮蔽效應誘導藻細胞合成更多的葉綠素，以利于在低光強時，微藻光合作用接受光子，既而導致葉綠素a含量變化。隨著實驗時間的延長，MWCNTs在培養基中的分散趨于穩定后，劑量效應占主導地位，藻細胞中葉綠素酯還原酶的合成受到抑制，影響了氨基-γ-酮戊酸的合成，降低了葉綠素含量，繼而抑制了蛋白核小球藻的生長[30]。

蛋白質是生物體的物質基礎，亦是酶系統的物質基礎，蛋白質對生物體的代謝活動起著至關重要作用[31]。蛋白核小球藻暴露在2種類型MWCNTs 96 h后，5 mg·L-1和10 mg·L-1P-MWCNTs實驗組以及5 mg·L-1、10 mg·L-1和20 mg·L-1MWCNTs-OH實驗組的藻蛋白質含量均有所增加。這可能是因為隨著MWCNTs濃度的增加，藻細胞內活性氧(ROS)開始積累，為了應對這種環境脅迫并保持細胞內ROS產生和消除平衡，藻細胞的抗氧化系統介入，更多的抗氧化酶在胞內合成以抵制脅迫，以使細胞能緩和由脅迫導致的損害。而以上生理過程中所涉及的酶是細胞可溶性蛋白質的組成部分[30]，所以胞內可溶性蛋白質含量輕微增加。而當蛋白核小球藻分別暴露在20 mg·L-1P-MWCNTs和40 mg·L-1MWCNTs-OH的實驗條件下，P-MWCNTs和MWCNTs-OH對蛋白核小球藻產生了一定的毒性效應。主要是因為藻細胞的抗氧化系統已不能有效抵御由過高濃度MWCNTs濃度導致的脅迫。同時，在過高濃度的P-MWCNTs或MWCNTs-OH條件下，2種納米材料穿過細胞膜進入細胞內的概率大大增加。此外，進入藻細胞內的MWCNTs會增加蛋白質水解酶的活性，加速蛋白質水解，導致了可溶性蛋白質含量減少[32]。

藻類的抗氧化防御系統與藻類細胞的機體健康狀況之間有著緊密聯系。防御系統分為酶系統和非酶系統，這2種系統協調作用，互相依賴。更強的抗氧化能力表明機體健康狀態更好且具有更強的抗脅迫能力。反之，機體健康狀態越惡劣且抗脅迫能力更弱。當P-MWCNTs濃度低于20 mg·L-1以及MWCNTs-OH濃度低于40 mg·L-1時，蛋白核小球藻細胞通過自己抗氧化系統介入調節，以抵御環境脅迫，藻細胞健康狀態良好，因此T-AOC值維持在高水平。當P-MWCNTs濃度≥20 mg·L-1以及MWCNTs-OH濃度≥40 mg·L-1時，蛋白核小球藻細胞的抗氧化系統已不能有效抵御環境脅迫，細胞健康狀況惡化，導致藻細胞活性降低并出現細胞凋亡現象，因此T-AOC值減小。

當蛋白核小球藻受到環境脅迫時，細胞內酶系統產生ROS，這些ROS能夠攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化，并促進合成脂質過氧化物。丙二醛(MDA)，一種脂質過氧化物，間接反映了ROS對藻類細胞的攻擊嚴重程度[33]。當細胞的T-AOC變弱時，藻類細胞的抗氧化系統受到干擾，ROS產生和清除的平衡被破壞，導致藻類細胞的ROS積累加劇和膜脂過氧化損傷，MDA含量迅速增加。同時，MDA又會抑制和降低抗氧化酶的活性和含量。