高效液相色譜法測定胡麻卵磷脂中磷脂酰肌醇含量

呂 旭，關(guān) 明，古再麗努爾·阿爾肯

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊市 830054)

卵磷脂(lecithin)是一種能夠提供豐富營養(yǎng)和特定功能的含磷極性類脂合物，它與維生素、蛋白質(zhì)并列譽(yù)為“第三營養(yǎng)素”[1-2]。卵磷脂的主要成分有磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)、磷脂酸(phosphatidic acid，PA)等[3]。著名專家Folch于1942年通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了肌醇磷脂，在已知的肌醇磷脂中磷脂酰肌醇是含量最多的[4]。磷脂酰肌醇在真核細(xì)胞中承載著許多重要的信號分子，同時(shí)在細(xì)胞膜中起著很重要的作用[5]。憑借著PI獨(dú)特的乳化等特殊性能，磷脂酰肌醇在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，市場需求量逐漸增加[6-7]。除了大家所熟知的大豆、花生等農(nóng)作物卵磷脂中磷脂酰肌醇含量豐富外，新疆自產(chǎn)的胡麻(Linumusitatissimum L)中也含有一定量的磷脂酰肌醇。

專家學(xué)者經(jīng)過幾十年的研究，目前對磷脂酰肌醇的測定方法有很多種。如郭勍[8]費(fèi)云蕓[9]等運(yùn)用了薄層色譜法 (TLC)對大豆中的磷脂酰肌醇進(jìn)行了定量檢測；Kim,Junhwan、Hoppel,Charles L[10]采用高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)在大鼠心肌和骨骼肌中檢測到磷脂酰肌醇等七類磷脂；高樹剛等人[11]對大豆磷脂中的磷脂酰肌醇采用氣相色譜法測定；李國輝等人[12]以V(乙醇)∶V(乙腈)∶V(水)=50∶40∶10為流動(dòng)相，建立了高效液相色譜紫外檢測器測定大豆保健品中磷脂酰肌醇等磷脂的測定方法；李志琴[13]以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.45∶0.05等為流動(dòng)相，運(yùn)用梯度洗脫HPLC-ELSD法測定蛋黃卵磷脂中磷脂酰肌醇等有關(guān)物質(zhì)。其中高效液相色譜法具有操作簡單、靈敏度高、分析測定速度較快、密閉性較好等優(yōu)點(diǎn)，被多數(shù)學(xué)者所采用。

本文以從新疆本地自產(chǎn)的胡麻油中精致提煉出的胡麻卵磷脂為研究對象，采用高效液相色譜法，甲醇-乙腈-異丙醇為流動(dòng)相，對胡麻卵磷脂中的磷脂酰肌醇進(jìn)行測定，為今后胡麻中磷脂酰肌醇的測定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡麻卵磷脂為本課題組精制，純度≧99%，磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥98%，購自Sigma公司)，甲醇、乙腈、異丙醇(色譜純，均購自Sigma公司)，二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Sino ChromODS-BP-C18柱(4.6mm×200mm×5μm)；Agilent 1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；AL-204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)品1mg用10 mL氯仿-甲醇(2∶1)溶解液至于標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中溶解稀釋，充分搖勻放在冰箱里冷藏，等待使用。

1.4 樣品處理

精密稱取胡麻卵磷脂樣品15 mg放置于50mL量瓶中內(nèi)，然后入三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解液稀釋至刻度線，充分搖勻放在冰箱冷藏，等待測試。

1.5 色譜條件

色譜柱：C18，4.6 mm×200 mm×5μm；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(異丙醇)∶V(乙腈) =37∶61∶2[14]；流速：1.0mL/min，等度洗脫；檢測波長：206nm；進(jìn)樣體積：每次10μL；柱溫：35℃。

1.6 液相色譜測定

用Agilent 1200高效液相色譜儀分別對配置好的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，根據(jù)磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間，再與樣品中組分的保留時(shí)間進(jìn)行比較，測定其色譜峰面積的響應(yīng)值，同一樣品進(jìn)行三次測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離度和線性關(guān)系

對流動(dòng)相中甲醇、異丙醇和乙腈的比例反復(fù)調(diào)試，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相甲醇∶異丙醇∶乙腈=37∶61∶2(體積比)時(shí)候，經(jīng)過等度洗脫卵磷脂中磷脂酰肌醇成分得到了較好的分離，分離度大于1.5。運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)品追加法和保留時(shí)間對照法可以確定磷脂酰肌醇的峰位置，磷脂酰肌醇保留時(shí)間約為2.5min 。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖

Fig.1 Chromatogram of standard product and sample

分別移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度約為5 μg/mL、10μg/mL、15 μg/mL、20μg/mL、25 μg/mL)注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，進(jìn)行濃度C(μg/mL)與峰面積A的相關(guān)性分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：磷脂酰肌醇在5.015～25.045μg/mL濃度范圍內(nèi)，C與A的線性回歸方程為A=1254.775C+1809.778，相關(guān)系數(shù)為0.99899，線性良好。

圖2 磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)擬合直線

Fig.2 Standard fitting line for phosphatidylinositol

2.2 精密度和重復(fù)性

取標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，測定每一次對照品的峰面積，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算可得出PI平均峰面積的RSD值為1.73%，精密度符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)的基本要求。

2.3 樣品測定

每次取胡麻卵磷脂樣品10μL注入高效液相色譜儀，重復(fù)5次，得出每一次的峰面積，然后帶入線性回歸方程可以算出測試樣品中磷脂酰肌醇的含量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析可知磷脂酰肌醇的含量平均約占胡麻卵磷脂5.394%，含量相對較少。

表1 樣品測定結(jié)果Table 1 Results of sample determination

2.4 加標(biāo)回收率

取稀釋后的胡麻卵磷脂樣品配成1mg/mL的溶液，加入3種不同質(zhì)量的磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行9次，測得的結(jié)果如下表2所示：

表2 回收率測定結(jié)果(PI)Table 2 Results ofrecovery tests (PI)

3 結(jié)論

建立了一種高效液相色譜與蒸發(fā)散射光檢測器聯(lián)用的方法，對胡麻卵磷脂中的磷脂酰肌醇進(jìn)行較好的分離及定量測定。測定出胡麻卵磷脂中磷脂酰肌醇平均約占5.394%，加標(biāo)平均回收率為98.58%，該方法操作簡單、穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度較高，可為胡麻質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

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