高效脫氨氮菌的分離純化及降解條件的響應面法優化

宦臣臣， 梁引庫， 閆志英

(1.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000； 2. 陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000; 3.中國科學院 環境與應用微生物重點實驗室， 成都 610041)

隨著規模化養殖業的迅猛發展，畜禽糞便、污水排放不斷增加，使得我國許多自然水體中的氨氮遠超出自然環境所能承受的范圍[1]。過量的氨氮造成包括主要湖泊河流在內的各類自然水體的富營養化現象十分嚴重，直接導致水體的自凈功能下降，BOD和COD等數據超標，帶來嚴重的生態環境污染問題[2]。目前，微生物菌劑脫除氨氮以其經濟、簡便、高效的優勢，正在成為水體脫氮的主力[3]。但現有的菌劑氨氮去除率低，僅為50%～80%，存在脫氨氮效果不理想等問題[4-6]。尋求新的高效的脫氨氮菌株已然成為目前亟待解決的問題之一。

響應面分析法是20世紀中后發展起來的優化試驗條件方法[7]。該方法采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的關系，對影響產量的各因子水平及其交互作用進行優化評價，并求出最佳值[8]。由于其能用較少的實驗數據推算出目標值的優化條件，優化效率高，在微生物方面得到了廣泛的應用[9]。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離及鑒定

樣品采自四川某污水處理廠二沉池活性污泥與實驗室的堆肥樣品，將采集的活性污泥與堆肥樣品在好氧條件下用含氨化合物的富集培養基進行馴化，富集4次，每次5天，20 d后對富集樣品進行梯度稀釋，從10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀釋度下吸取0.25 mL于分離培養基平板涂布，30℃恒溫培養，進行多次的純化分離，挑選出形成的單菌落進行異樣硝化能力測試[10]。篩選出具有較好的異養硝化特性的菌株至于甘油，冷凍保存。

生態學鑒定：對菌體進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察染色結果并拍照；以及通過掃描電子顯微鏡拍攝照片來觀察菌株DFN2的形態。

分子生物學鑒定：使用細菌基因組DNA提取試劑盒，提取菌株的基因組DNA，以此為模板，利用16SrDNA基因通用引物，進行PCR擴增。擴增16SrDNA的引物：FprimerF27 ：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和R-primerR1492 ：5’-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。對擴增好的PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測PCR產物，產物由成都擎科生物工程技術服務有限公司測序。測得的序列登陸NCBI網站，通過Blast 程序與Genbank中核酸數據進行比對分析，使用MEGA6.0軟件繪制菌株進化發育樹。

1.2 主要培養基

富集培養基(g·L-1)：(NH4)2SO42.0,琥珀酸鈉13.85，乙酸鈉5.0，葡萄糖5.0，維氏鹽溶液50 mL,pH值7.0。維氏鹽溶液配制(g·L-1)：K2HPO45.0，MgSO4·7H2O 2.5，NaCl 2.5，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO40.05，pH值7.0。

分離培養基(g·L-1)[11]：(NH4)2SO40.47,琥珀酸鈉 5.62,維氏鹽溶液50 mL, pH值7.0，固體培養基添加2.0%瓊脂，121℃，30 min高溫滅菌處理。

牛肉膏蛋白胨培養基(g·L-1)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，加水至1 L，pH值7，固體培養基添加2.0%的瓊脂，121℃，30 min高溫滅菌處理。

1.3 菌株培養條件的優化

1.3.1 單因素實驗

將菌株DFN2分別接種在不同pH值(5，6，7，8，9)的脫氮培養基中，于35℃，160 r·m-1條件下培養14 h后取樣，測定其氨氮的降解率以及OD600，考察不同pH值條件下菌株對氨氮的降解影響。

將菌株DFN2接種到脫氮培養基中，分別于25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，160 r·min-1條件下培養14 h取樣，測定其氨氮的降解率以及OD600，考察不同溫度條件下菌株對氨氮的降解影響。

將菌株DFN2按1%，3%，5%，7%，9%的接種量接種到脫氮培養基中，于35℃，160 r·m-1條件下培養14 h后取樣，測定其氨氮的降解率以及OD600，考察不同接種量條件下菌株對氨氮的降解影響。

1.3.2 響應面法實驗

在單因素實驗的基礎上，根據BOX-Behnken 的中心組合實驗設計原理，選取pH值(A)、溫度(B)、接種物濃度(C)為變量，以氨氮的降解率(Y)為響應值，每個變量按低、中、高3個水平分別以-1，0，+1進行編碼[12]。

實驗因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素和水平

1.4 分析方法

1.5 菌株DNF2對沼液廢水的降解

在響應面優化條件下，將菌株DFN2接種到沼液廢水中，測定菌株對廢水中氨氮的降解情況。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定及生長曲線測定

菌株DFN2的菌落特征為圓形、表面濕潤、乳白色、不透明、有光澤、邊緣整齊。經革蘭氏染色通過顯微鏡觀察可知該菌為革蘭氏陰性菌(見圖1)；通過掃描電鏡(見圖2)觀察到菌體為桿狀，大小約為0.4 μm×(0.9～1.5)μm。

經16srDNA測序BLAST同源性檢索，發現菌株DFN2與Alcaligenesfaecalissubsp.phenolicus(DSM 16503(T))的相似性在99%以上，結合菌株的形態學特征，初步確定該菌株為糞產堿桿菌亞種酚類。使用MEGA 6.0軟件，以Neighbor-Joining[14]法繪制系統發育樹，結果如圖3所示，得到DNF2的系統進化樹，進一步表明菌株DFN2為Alcaligenesfaecalissubsp.Phenolicus。

根據光密度OD600與時間的關系，采用Bioscreen C儀器測定菌株DFN2的生長曲線，如圖4所示。由圖可知菌株DNF2在24 h達到對數生長期，24～96 h之間為穩定期，96 h之后開始進入衰亡期。根據菌株的生長曲線，在進行菌株脫氨氮實驗時，選擇對數生長期和穩定期交界點(24 h)的菌液為種子液，以保持菌株的最高活性和穩定性。

圖1 菌株DNF2 的革蘭氏染色圖

圖2 菌株DFN2的掃描電鏡照片

圖3 菌株DFN2的系統進化樹

圖4 菌株DFN2生長曲線

2.2 單因素實驗分析

2.2.1 pH值的影響

由圖5可知，菌株DNF2能在不同pH值條件降解氨氮。在弱堿環境下(pH值8～9)對應的氨氮去除率分別為72.5%，71.06%，OD600值分別為1.018，0.969。在中性條件下(pH值為7)氨氮的去除率為78.39%，OD600值為1.025。在弱酸性條件下(pH值5～6)，氨氮去除率降至54.5%，69.8%，OD600值分別為0.85，0.94。可見菌株最佳生長條件為pH值為7時。菌株DNF2適應的pH值范圍與王兆陽[15]、梁賢[11]等研究的菌株大致相同。

2.2.2 溫度的影響

由圖6可知，菌株DNF2可在不同的溫度條件下降解氨氮。在溫度為25℃時，菌體密度為0.5，去除率為46%，隨著溫度的升高，菌體生長量和氨氮去除率增加，特別是在溫度為35℃時，氨氮的降解率達到最高，為79.2%，菌體密度為1.02。當溫度過高為40℃和45℃時，菌體密度明顯降低，氨氮去除率也下降，這是因為隨著溫度升高，生物活性物質變質，細胞功能下降甚至死亡，影響反應效果[16]。

圖5 pH值對菌株DFN2的影響

圖6 溫度對菌株DFN2的影響

2.2.3 接種微生物濃度

如圖7可知，將菌株DNF2以不同接種物量接種到脫氨培養基中，其降解效率不同。當菌體接種量為5%時，氨氮降解效率最大，高達78.9%，且菌體密度較大。其他接種條件下降解效率均低于接種量為5%時，原因可能是菌液接種量少時，營養充足，菌液與氨氮充分接觸，雖然降解不完全，但降解速度快；接種量過多時，營養物不足，菌種之間相互競爭，導致降解速度相對降低。

2.3 響應面試驗結果及數據分析

2.3.1 試驗設計方案及結果

根據單因素實驗結果，由Design-Expert 8.0.6 統計軟件分析設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示，以氨氮濃度降解率為響應值(Y),以pH值(A)、溫度(B)、接種物濃度(C)為自變量，建立三因素三水平中心組合實驗設計共包括17個實驗方案，其中有5個中心實驗點，用以計算實驗誤差。

圖7 接種物濃度對菌株DFN2的影響

實驗號ABC氨氮降解率 / %1-10-164.9200086.530-1135.9400091.15-1-1025.7600091.67-10152.1801126.4910-173.51000092.61101-127.31211037.0130-1-151.61400091.5151-1044.31610178.717-11015.2

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert8.0.6 軟件對所得數據進行二次回歸分析，分析結果見表3，對各因素回歸擬合后，得到二次回歸方程如下：

Y=90.66+9.45A-6.45B-3.03C+0.80AB+4.50AC+3.70BC-14.06A2-46.06B2-9.31C2

表3 回歸方程的方差分析結果

注：＊＊＊差異極顯著(p<0.001)；＊＊差異高度顯著(p<0.01)；＊差異顯著(p<0.05)

2.3.3 響應面圖分析

根據回歸方程繪制氨氮降解率隨各因素變化的響應面曲面圖。由響應面曲面圖可知pH值、溫度、接種物濃度這3個因素對氨氮降解率的影響(見圖8～圖10).每個響應面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用，另一個因素保持在編碼的0水平[17]。

圖8 Y=f(AB)響應面和等高線

圖8結果顯示，pH值和溫度的交互作用不顯著。在pH值一定的條件下，隨著溫度的增加，氨氮的降解率會迅速地升高，然后下降。在溫度一定的條件下，隨著pH值的增加，氨氮的降解率緩慢升高至平穩，然后下降。

圖9結果顯示，pH值和接種物濃度之間交互作用顯著。在pH值一定的條件下，隨著接種物濃度的增加，氨氮的降解率逐漸升高至平穩，然后下降。在接種物濃度一定的條件下，隨著pH值的增加，氨氮的降解率緩慢升高至平穩，然后略有下降。

圖9 Y=f(AC)響應面和等高線

圖10結果顯示，溫度和接種物濃度之間交互作用顯著。在溫度一定的條件下，隨著接種物濃度的增加，氨氮的降解率逐漸升高至平穩，然后下降。在接種物濃度一定的條件下，隨著溫度的增加，氨氮的降解率迅速升高至平穩，然后下降。

圖8～圖10直觀的反映了各因素對響應值的影響，由圖可知pH值和溫度的交互作用不顯著，pH值和接種物濃度之間交互作用顯著，溫度和接種物濃度之間也有顯著的交互作用。并且可以得出A，B，C存在極值點，通過Design-Expert 8.0.6軟件可以得到Y(氨氮降解率)最大估計值為92.54%，對應的各因素為pH值為7.63，溫度為34.29℃，接種物濃度為4.6%，即為最優的氨氮降解條件。

圖10 Y=f(BC)響應面和等高線

為了驗證響應面分析的可靠性，采用上述最佳工藝參數進行實驗驗證，用脫氮菌株DFN2進行3次搖瓶實驗，培養14 h后離心，取上清，采用紫外分光光度計定量測定驗證。優化條件下氨氮的平均降解率為92.05%，平均氨氧化速率為與優化前的條件相比，菌株降解氨氮的能力提高了12.85%。結果表明，經過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合，證明用響應面法可以有效地優化培養條件，促使菌株降解氨氮的能力得到了很大的提升。

圖11 菌株DNF2降解沼液廢水

2.4 菌株DNF2降解沼液氨氮試驗

根據響應面試驗，在降解條件最優的條件下，將菌株DNF2接種沼液廢水中，結果如圖11所示，在初始氨氮濃度為416.23 mg·L-1條件下，菌株在84 h時可將氨氮降解到8.53 mg·L-1，降解率為97.95%，在96 h時，氨氮濃度為2.41 mg·L-1，降解效率為99.42%。

3 結論

(1)從堆肥和活性污泥中分離得到一株能高效降解氨氮的菌株DNF2。經鑒定為糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalissubsp. Phenolicus)。

(2)通過單因素實驗，采用Box-Behnken設計對菌株DNF2降解氨氮條件進行優化，建立了氨氮降解回歸模型，該模型優化的降解條件為：pH值為7.63，溫度為34.29℃，接種物濃度為4.6%。在此條件下，通過驗證試驗測得氨氮的降解率可達92.05%，與優化前的條件相比，菌株降解氨氮的能力提高了12.85%，與模型預測結果相近，進一步驗證了模型的可靠性。

(3)在優化條件下，將菌株DNF2接種到沼液廢水中，96 h可將416.23 mg·L-1氨氮降解至2.41 mg·L-1，降解效率為99.42%。