重組人胰高糖素樣多肽-1(rhGLP-1)對人肝細胞系HL-7702胰島素信號通路的影響

張學年，姚 瑤，王宏宇，王 意，徐 春

胰高糖素樣多肽-1(GLP-1)是由小腸L細胞分泌的一種激素，是由37個氨基酸組成的肽鏈，其中第7到第36個氨基酸的片段GLP-1(7-36)具有生物活性，GLP-1(7-36)作用于β細胞膜的GLP-1受體，促進胰島素分泌[1]。體內的GLP-1很快被二肽基肽酶-4(DPP-4)分解,GLP-1受體激動劑的結構與人GLP-1有差異，不會被DPP-4酶降解。rhGLP-1(7-36)是基因合成的人GLP-1(7-36)，與人GLP-1生物活性片段完全一致，用rhGLP-1(7-36)研究GLP-1在肝細胞中的作用機制，較用GLP-1受體激動劑更能反映人體自身的情況。

Akt又稱PKB，是胰島素信號通路PI3K/Akt中的重要信號分子。Akt的激活與兩個位點的磷酸化有關：Ser473和Thr308，Akt在Ser473或Thr308位點的磷酸化(p-Akt)導致PI3K/Akt信號通路的激活。在人肝細胞中，PI3K/Akt信號通路的激活可激活mTORC通路,導致血脂的合成[2]。本研究通過測定人肝細胞HL7702中的Akt和p-Akt的表達量，探究GLP-1對人肝細胞PI3K-AKT-mTORC信號通路的影響，揭示GLP-1降低血脂的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人肝細胞系 HL-7702細胞株，購自上海中科院細胞所，培養條件：10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI1640培養液于37 ℃，5%CO2的濕化培養箱中培養。

1.1.2 主要試劑 rhGLP-1(7-36)由上海仁會生物制藥股份有限公司惠贈；兔來源p-Akt(Thr308)單克隆抗體、兔來源p-Akt(Ser473)單克隆抗體、兔來源Akt單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標記抗鼠/兔IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司。鼠來源actin單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理 人肝細胞系HL-7702細胞株培養至對數生長期，按5×105/ml的密度均勻接種于60 mm培養皿上，隨機分為4組：GLP-1低濃度組、GLP-1中濃度組、GLP-1高濃度組和對照組。細胞在37℃、5%CO2的濕化培養箱中培養24 h后，藥物組分別更換為含有rhGLP-1(7-36)10 nM、100 nM、1000 nM的RPMI1640培養基繼續培養24 h，空白對照組用RPMI1640培養基，所有細胞于37℃、5%CO2濕化培養箱中繼續培養24 h。

1.2.2 蛋白質免疫印跡法(westernblot) 各組細胞培養24 h后，棄掉培養液，用RIPA裂解液充分裂解，16 000 g離心20 min。收集上清液，BCA法測定蛋白濃度并分裝。制備8%分離膠和5%濃縮膠(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，SDS-PAGE)，等量蛋白與4×上樣緩沖液混合，沸水中加熱5 min至蛋白變性。蛋白上樣，電泳。在100 V電壓下將蛋白轉至硝化纖維膜上。將膜用含5%脫脂奶粉的封閉液孵育3 h，而后孵育一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室溫下孵育二抗1 h。再次用TBST洗膜3次，每次5 min。用化學發光凝膠成像系統檢測，用Image軟件進行灰度分析。所有實驗均重復3次以上。

1.3 統計學處理 使用SPSS22.0軟件對數據進行統計分析。各組數據間的顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GLP-1對人肝HL7702細胞系Akt表達量的影響 與對照組相比，GLP-1低濃度組、GLP-1中濃度組、GLP-1高濃度組 Akt 蛋白的表達水平無明顯差異(表1)。

2.2 GLP-1對人肝HL7702細胞系p-Akt表達水平的影響 與對照組相比，p-Akt(Thr308)的表達量在GLP-1低濃度組、GLP-1中濃度組、GLP-1高濃度組明顯下降；p-Akt(Ser473)的表達量在對照組與GLP-1不同濃度組之間差異均無統計學意義(表1)。

分組Akt表達量p-Akt(Ser473)表達量p-Akt(Th308)表達量對照組1±01±01±0GLP-1低濃度組0.85±0.120.58±0.090.60±0.27①GLP-1中濃度組0.83±0.050.65±0.150.54±0.15②GLP-1高濃度組0.69±0.280.69±0.220.61±0.18①

注：與對照組比較，①P<0.05，②P<0.01

3 討 論

GLP-1類降糖藥的作用機制尚未完全揭示，目前研究認為，GLP-1與胰島β細胞表面的GLP-1受體結合，激活PKA通路和PI3K-AKT通路，導致一系列生物學效應[3]。關于GLP-1在肝細胞的作用也有研究，Guptal等[4]發現在人肝細胞表面存在GLP-1受體，GLP-1受體激動劑艾塞那肽通過調節肝細胞胰島素信號傳導系統，減少肝細胞的脂肪變性。最近很多研究發現GLP-1類藥物具有調節血脂的作用：GLP-1降低糖尿病大鼠血清膽固醇和三酰甘油水平[5]；GLP-1降低糖尿病大鼠脂肪合成關鍵酶FAS的mRNA表達[6]。本研究發現rhGLP-1(7-36)對人肝細胞p-Akt的表達具有抑制作用，提示GLP-1抑制PI3K-AKT-mTORC信號通路。

PI3K-AKT-mTORC信號通路在人肝細胞脂代謝中起重要作用[2]，當血糖濃度升高時，胰島素分泌增加，激活PI3K-AKT-mTORC信號通路，促進肝細胞合成脂肪。2型糖尿病患者的高胰島素血癥在肝臟出現了選擇性胰島素抵抗，即促進血脂合成的PI3K-AKT-mTORC信號通路處于激活狀態，而促進糖原合成的PI3K-AKT通路處于抵抗狀態，導致糖

尿病患者高血糖高血脂并存的臨床表現[7]，抑制肝細胞PI3K-AKT-mTORC信號通路將會減少血脂的合成。本研究發現rhGLP-1(7-36)明顯抑制肝細胞p-Akt的水平，提示GLP-1對肝細胞 PI3K-AKT-mTORC信號通路可能具有抑制作用。GLP-1在肝細胞通過抑制PI3K-AKT-mTORC信號通路降低脂肪的合成，這可能是GLP-1類降糖藥降低血脂的機制之一，進一步研究需要分析PI3K-AKT-mTORC的下游靶蛋白如SREBPc-1的表達，以明確GLP-1對這一通路的抑制作用。

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