軟骨發育不全1例臨床特點及其基因突變分析

張亞妹，萬乃君，孫慧慧

軟骨發育不全(achondroplasia，ACH)是一種先天性軟骨發育異常性疾病，屬于常染色體顯性遺傳疾病，80%為散發病例。其主要臨床表現為短肢型侏儒癥，表現為不成比例的身材短小、巨顱、前額突出、面中部發育不良、“三叉手”、關節過伸、腰椎過度前突等，智力一般都正常[1]，壽命接近正常人。此病于1878年首次報道[2]，發病率1/10000-30000活產嬰兒[3]，全世界大約有25萬人罹患此病,男女比例無差別。一般最終的成年身高男性為(131±5.6)cm，女性為(124±5.9)cm[4, 5]。成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)基因是ACH的重要致病基因，外顯率100%，絕大多數為雜合突變，1138位核苷酸點突變是為最常見的突變，約90%為1138G>A，余不到10%G>C[6-8]，此外1123G>T(G375C)突變也報道過[9]。我院收治一例ACH患者的臨床資料，對患兒進行遺傳性骨病的Ⅱ代測序，確定本患兒是否存在FGFR3基因突變，結合患兒臨床特點及基因突變表型。

1 病例報告

1.1 一般情況 患兒，男，1歲6個月，因“生長遲緩1年6月”于2017在北京積水潭醫院兒科門診就診，對患兒及父母建立臨床資料信息登記表、簽署知情同意書，并收集患兒及其父母外周血DNA。患兒男，G1P1，孕41周，因頭盆不稱剖宮產出生，出生體重3900 g，出生身長50 cm，入院查體：身長71.7 cm(p<3 th)，體重10.3 kg(p10-25 th)，頭圍52 cm(p>97 th)，上部量占身長的60%，下部量占身長的40%，自小身高較同齡人矮，頭大，四肢短粗，鼻梁塌陷，睡眠打鼾伴呼吸困難，“三叉手”，腰椎過度前突，臀部后翹，下肢彎曲畸形，智力正常。患兒父母為非近親結婚，體型外貌無異常，家族中無特殊疾病。

1.2 輔助檢查

1.2.1 X線檢查 左手左腕正位骨齡大致相當于1.5歲左右，雙手尺橈骨干骺端增寬(圖1)。胸腰段部分腰椎改變，胸腰椎椎體不規則變扁，腰骶角增大，代謝性骨病(圖2)。

圖1 左手左腕正位骨齡片

圖2 脊柱

1.2.2 血液樣本采集和DNA提取 收集患者及其父母的外周血。

1.2.3 二代測序 從受檢者外周血中提取基因DNA，構建基因組文庫，然后通過探針雜交捕獲與遺傳性骨病相關基因的外顯子及相鄰內含子區域(50 bp)，并進行富集，富集的目的基因片段通過下代高通量測序儀(Illumina)進行測序。

測序數據運用Next Gene V2.3.4軟件與UCSC數據庫提供的人類基因組 hg19 參考序列進行比對，并對目標區域的覆蓋度和測序質量進行評估。依據嚴格的篩選標準對變異進行過濾，并添加HGMD數據庫、蛋白功能預測軟件的相關注釋信息，對明確或可能與受檢者臨床表型相關的基因變異，采用Sanger測序進行驗證，上述檢測均由北京信諾佰世醫學檢驗所完成。

1.3 結果 對患者及其父母進行基因分析，檢測受檢者與遺傳性骨病相關的473個基因，對測序數據進行深入分析，確定了可能的突變基因，并對受檢者及其父母進行一代測序驗證。突變位點及其臨床意義的詳細信息如下：

1.3.1 遺傳學意義 本研究在患兒FGFR3基因發現c.1138G>A/(p.G380R)雜合突變，為HGMD報道的已知致病性突變。未發現受檢者父母攜帶上述突變，因此推測該突變為新生突變，但不排除父母存在生殖細胞嵌合體的可能，具體見測序圖(圖3)。

1.3.2 測序圖 一代驗證結果 FGFR3基因c.1138G>A(p.G380R)雜合突變，未在受檢者父母外周血中檢測到。

圖3 反向測序結果

2 討 論

ACH是一種常見的軟骨發育異常，其發生率在軟骨發育異常中最高，且發現較早。ACH的患兒表現為四肢短小，軀干相對細長，伴有巨顱，前額突出，面中部發育不良，“三叉手”，關節過伸，腰椎過度前突等異常。患兒的肢體遠端受累會輕于近端，表現為脛腓骨及尺饒受累較股骨及肱骨輕。隨著患兒年齡的增長，這種差異會更加顯著，形成特殊的畸形，稱為侏儒畸形。對ACH患者的研究，發現所有患者均為成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)基因編碼的基因FGFR3突變所致。FGFR3屬于成纖維細胞生長因子受體家族成員之一，是一種具有調節生長發育等功能的跨膜蛋白。FGFR3基因位于4p16.3上，此基因長度約為16.5 kb，有19個外顯子和18個內含子，其中第10外顯子編碼FGFR3跨膜區[10]，含有806個氨基酸殘基，由胞外區，疏水跨膜區，胞內酪氨酸激酶活性區3部分組成。FGFR3為無活性單體，與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)2、4、9結合后，聚合為二聚體，激活胞內區酪氨酸激酶活性，使其酪氨酸殘基磷酸化，啟動下游信號傳導通路。現研究FGFR3主要是通過激活信號傳導和轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription, STAT)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路發揮作用，STAT1通路抑制軟骨細胞增殖，MAPK通路抑制軟骨細胞向肥大細胞分化[11]，其通過抑制軟骨細胞增生分化，抑制軟骨細胞外基質合成及促進其降解而發揮骨骼生長調節作用[12]。但生理情況下FGFR3活化后會被迅速泛素化，隨后被蛋白酶體降解，信號傳導隨即終止，從而調節軟骨的成骨。但ACH患兒，由于FGFR3基因1138位核苷酸點突變G>A，該突變導致了甘氨酸置換成精氨酸，使跨膜區結構改變，影響蛋白功能，這種改變會增強酪氨酸活性，干擾泛素化反應，延緩蛋白酶體的降解，延長傳導時間，從而增強了FGFR3對軟骨細胞增殖和分化的負性調節作用,干擾了軟骨內成骨[13]，而軟骨內成骨是長骨線性生長的主要方式[14]。不僅FGFR3基因1138G>A突變會改變跨膜區的結構，1138G>C突變、1123G>T突變均會改變跨膜結構，干擾軟骨成骨。本研究我們報道的1例ACH患者，臨床表現為身高較同齡人矮，頭大，四肢短粗，鼻梁塌陷，睡眠打鼾伴呼吸困難，“三叉手”、腰椎過度前突，臀部后翹，下肢彎曲畸形。外觀表現典型，進一步對其骨骼系統的致病基因捕獲，患兒攜帶ACH的常見基因FGFR3突變，基因1138位核苷酸點突變G>A，為ACH最常見突變類型。ACH雖為常染色體顯性遺傳，外顯率100%，但實際卻多為散發病例報道。我們報道的病例，其父母表型均正常。Fryns等[15]認為，此種現象可能由新生突變或生殖細胞嵌合突變所致(嵌合突變即一方的生殖細胞存在正常和突變兩種細胞)。另一方面散發原因與罹患者因自身疾病終身未婚或婚后未生育，導致致病基因沒有了下一代延續有關。因此建議有家族史或生育過ACH患兒的父母如再次生育仍需進行產前監測并完善基因學檢測。目前有報道ACH致病基因其實多來自父親，與父親年齡呈相關性。因為男性精子形成后持續終身，隨著男性年齡的增長，在反復增殖與分化的過程中，攜帶突變的精原細胞及精子的比例逐漸升高，因此ACH的發生會隨著父親年齡風險成倍增長[16]。此例患兒母親28歲，父親32歲，父親年齡較大，結合我國目前國情，我國剛剛進入二胎全面放開時期，高齡父母將成倍增多，ACH的發病率可能會上升。

ACH的患者智力水平、壽命、性發育和常人基本相同，但他們生活質量卻很低。除了短身材帶來的身心問題之外，多系統骨骼的異常導致的相關并發癥才是影響生活質量的主要原因。例如頭頸頜面骨骼發育畸形，造成了解剖學上氣道的狹窄，狹窄的氣道可導致反復地呼吸道及中耳的感染，反復的中耳炎又會引起聽力的下降，甚至耳聾的發生[17]，一部分病例甚至發生聽力受損后的繼發言語延遲。腦積水也是ACH的常見并發癥，它是由于顱頸交接區狹窄導致腦室擴大，腦脊液過度分流所致，臨床常表現頭圍增大。脊柱方面的畸形也較多，包括齒突發育不良、枕骨大孔狹窄、椎弓根短小、椎體扁平、椎管狹窄、胸腰段后凸、脊柱側突等[18]，并且脊柱畸形隨生長而進展，這樣脊髓腔壓力可逐漸增高導致神經系統受壓病變，臨床上就會逐漸出現肢體的麻木疼痛、感覺異常、進行性肌肉張力減退，行走障礙和大小便失禁。嬰兒猝死是最嚴重的并發癥。ACH嬰兒猝死發生率比普通孩子增加6倍[19]，1歲之內嬰兒被報道的病例可達到7.5%[20]。它的發生是由于患兒腦干脊髓受壓、頜面發育異常、扁桃體肥大及腺樣體肥大協同作用。四肢的成角畸形在整個生長發育期會一直存在，因此對于ACH患兒我們需要更關注他并發癥的預防和治療，改善其生活質量。本例患兒頭大，鼻梁塌陷，夜間打鼾伴呼吸困難，提示患兒可能存在腦積水及呼吸道梗阻問題，在我們進一步的隨訪中需要定期監測呼吸功能，及時干預盡量減少并發癥對其生活影響。

目前關于ACH尚無有效治療手段，仍是控制癥狀和減輕并發癥的后果，2014年曾評估了他汀類藥物對骨骼生長的作用，其可能通過對軟骨細胞的合成代謝作用來刺激骨生長[21-23]，但具體機制尚不清楚，可能與他汀類藥物會加速FGFR3的降解有關[24, 25]。目前雖有大量關于他汀類藥物在人體內使用的數據，但人們對于兒童的用藥安全仍不確定，需要進一步臨床研究證實。另一方法用于暈動病的非處方抗組胺藥物美克洛嗪在動物實驗也取得一定效果，治療的小鼠骨生長有所改善[26]，但機制也尚不明確。利鈉肽類似物C型鈉尿肽類似物(C type-natriuretic peptide, CNP)、FGFR3誘變因子(sFGFR3)，一種12氨基酸多肽(P3)及小分子針對酪氨酸激酶等藥物也在研究階段。這些方法均為以后的治療提出了新的希望，也是目前研究的熱點，這些治療可能可以預防ACH各種并發癥的發生。目前通過產前診斷阻止重癥患兒出生是首選的預防措施。對于正常的孕婦來說，超聲仍是診斷的主要方法，孕晚期超聲通過判斷股骨、肱骨長度，臨床把長度<2SD，或低于相應孕周參考值的第5百分位[27],同時可伴有雙頂徑與孕周不相符，三叉手，面中塌陷及羊水量增多等異常輔助診斷[28]作為篩檢對象；但其局限性是一般確診都在孕晚期或出生后。因此建議一方或雙方ACH患者或曾生育過ACH患兒的家庭，在孕早、中期通過侵入性產前檢查FGFR3基因進行早期診斷，FGFR3基因熱點的檢測仍是目前對胎兒早期確診的最直接最有效的檢測。

綜上所述ACH是一種常染色體顯性遺傳病，是由于FGFR3基因突變所致，絕大多數突變是1138G>A突變，少數是1138G>C突變。它臨床導致多系統骨骼異常并伴有多種并發癥，目前對于ACH尚無有效治療方法，因此產前篩查對于預防此病和早期診斷至關重要，建議對高危人群需及時進行FGFR3基因熱點檢測。

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