pIRES2-EGFP-prnd真核表達載體的構建及其在BHK細胞中的表達

程艷芬 ，寧章勇 ，馮翠萍 ，趙孟孟 ，安玉甫 ，吳新濤

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801；2.華南農業大學獸醫學院，廣東廣州 510642）

傳染性海綿狀腦病（Transmissible spongiform encephalopathy，TSE）是人與動物共患的神經性疾病[1]。許多研究表明，該病是由朊蛋白質錯誤折疊引起的，即正常細胞內源性的朊蛋白PrPc翻譯后變為富含β折疊PrPsc引起的[2-3]。但其發病機理仍然不清楚。疊朊蛋白（Prnp downstreamprion-like protein，Doppel）是由prnd基因編碼的，位于朊蛋白基因的下游，與朊蛋白基因具有生化及結構的同源性，由于PrPsc是PrP的同工型，被認為是朊病毒病的病原[4]，因此，分離并純化Dpl蛋白被認為能夠幫助進一步描繪PrP的功能，并鑒定PrP和Doppel與TSE的潛在相關性，然而，Doppel是否參與TSE的發生依然是一個有爭議的問題。已有研究表明，Doppel參與了多種神經細胞的死亡、凋亡與退化的過程[5-7]以及多種組織學來源的腫瘤的發生[8]。因此，獲得Doppel的生理生化表達是深入研究Doppel功能的必要步驟。

Doppel與PrPc雖然結構上極為相似，但是組織學分布和生理功能有明顯差異[8]。目前，Doppel蛋白還無法大量從組織中純化，而獲得較純的Doppel蛋白對于研究其結構和功能及在相關疾病中的作用至關重要。原核表達的Doppel蛋白由于缺乏翻譯后折疊、加工、修飾和轉運，無法精準地展示其生物學特性及生理生化功能，因此，不是研究Doppel蛋白結構和功能的首選。BHK細胞為幼地鼠腎細胞，其本身沒有疊朊蛋白的表達，為實驗室一直保存，轉染相應表達質粒后，所檢測到的疊朊蛋白全都來自克隆的載體。

本研究構建BALB/c小鼠Doppel基因prnd的重組真核表達質粒pIRES2-EGFP-prnd，并使其在BHK細胞中獲得表達，為進一步研究Doppel蛋白的結構、正常的生理生化功能及其與相關疾病的關系提供了重要工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和細胞 BHK細胞系、大腸桿菌JM109和pMD18-T Vector為華南農業大學獸醫學院病理教研室保存；pIRES2-EGFP Vector購自Clonetech公司。

1.1.2 BALB/c小鼠 其購自中山大學醫學院實驗動物中心，6周齡，雄性，SPF級。

1.1.3 主要試劑 DMEM等細胞培養相關試劑購自Gibco公司；RNA提取、DNA連接酶等基因克隆相關試劑購自大連寶生物工程有限公司；prnd多克隆抗體購自ProteinTech Group公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1BALB/c小鼠睪丸總RNA的提取 將BALB/c小鼠麻醉后處死，取睪丸組織，按照試劑盒說明書進行總RNA提取，-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成和PCR反應 按照試劑盒說明書提取cDNA，于-20℃保存。

參照GenBank登錄的BALB/c小鼠prion protein-likeproteinmRNACDS區（登錄號 GQ245668.1）設計1對引物，上游引物：5′-CCGCTCGAGAGGGG CATAAAGCATAGGTTC-3′，含有 Xho I位點；下游引物：5′-ATAACTGCAGGGCTCCCCTTTCCAGCCA GA-3′，含有Pst I位點。目的片斷長度約為400 bp。引物由Takara公司合成。PCR反應總體積為25 μL，其中，cDNA模板2 μL，prnd基因上下游引物稀釋至 12.5 pmol/L，各加 1 μL，Ex Taq 酶 0.2 μL，dNTP Mixture 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL。反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，66 ℃ 40 s，72℃ 50 s，38 個循環；最后72℃延伸10 min。

1.2.3 pMD18-T-prnd的構建和鑒定 按照常規方法構建重組質粒，經酶切和測序鑒定正確的質粒命名為pMD18-T-prnd。

1.2.4 pIRES2-EGFP-prnd的構建 對pIRES2-EGFP和pMD18-T-prnd同時進行Xho I，Pst I雙酶切，常規方法進行連接、轉化、提取質粒。酶切并測序確認目的片段正確插入，鑒定正確的質粒命名為pIRES2-EGFP-prnd。

1.2.5 重組質粒的轉染 用常規方法復蘇BHK細胞，參照轉染試劑盒說明書將pIRES2-EGFP-prnd轉染細胞，24，48 h后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.6 IFA檢測 用100%甲醇固定[9]轉染后24，48 h的BHK細胞，常規方法進行IFA檢測，熒光顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 prnd基因RT-PCR產物的克隆鑒定

經擴增得到1條約500bp的清晰條帶。pMD18-T-prnd 經 XhoI，PstI雙酶切后，獲得約 500，2900bp的2條酶切片段（圖1），測序結果也表明克隆成功。

2.2 pIRES2-EGFP-prnd的構建

pIRES2-EGFP-prnd的雙酶切鑒定結果表明，pIRES2-EGFP-prnd構建成功（圖1）。

2.3 BALB/c小鼠基因prnd在BHK細胞中的表達

轉染表達質粒到BHK細胞1，2 d后，分別用熒光顯微鏡觀察到非常明顯的熒光（圖2），表明prnd基因和EGFP基因可以在BHK細胞內融合表達。

2.4 轉染后BHK細胞的IFA檢測

對100%甲醇固定的BHK細胞進行間接免疫熒光（IFA）檢測，結果如圖3所示。在熒光顯微鏡下，可以看到BHK細胞有熒光的表達，表明pIRES2-EGFP-prnd質粒中的prnd基因在BHK細胞中進行了轉錄表達，產生Doppel蛋白。

3 討論

Doppel是朊蛋白家族的成員，至今仍不清楚其正常的生理功能。對其正常生理功能的正確詮釋是研究其在相關疾病發生過程中的作用必不可少的。已有研究表明，Doppel在正常的骨髓細胞中難以被檢測到，而幾乎所有的骨髓疾病患者如急性骨髓白血病和骨髓發育異常綜合癥患者的骨髓細胞中都能檢測到Doppel的表達[10-11]，統計數據表明，Doppel的表達水平與骨髓疾病相關的臨床或實驗室指標關系不大，不能用來預測骨髓疾病的發生。但是，在骨髓發育異常綜合癥發展為急性骨髓白血病的過程中，Doppel的表達水平顯著升高，可以作為評估臨床骨髓疾病發展的依據[12]。此外，Doppel在星形細胞瘤及其他組織來源腫瘤的患者體內表達顯著升高，其在這些腫瘤的發生發展過程中的功能還需要進一步研究[11，13]。獲得Doppel的正常表達水平以及其表達水平升高導致的生理功能的改變是深入研究其在TSE及腫瘤等相關疾病診斷中功能的必要步驟。本研究初步構建了Doppel蛋白的基因工程細胞，為進一步研究在細胞水平上Doppel蛋白的正常結構和生物學意義以及其與相關疾病發生、發展的關系奠定了基礎。

prnd的轉錄產物和表達產物的分布在不同組織、不同發育階段差異很大[14]。在新生敘利亞倉鼠的大腦皮層中，只能檢測到prnd mRNA的表達，Doppel蛋白的表達無法用現有手段檢測到；成年后，其大腦皮層中prnd mRNA的表達也檢測不到。而無論新生的還是成年的敘利亞倉鼠，睪丸是包括心、脾、腦、骨髓、肌肉中prnd mRNA及其相關蛋白的表達量最高的組織[15]。BALB/c小鼠是研究神經退行性疾病的重要動物模型，因此，用發育成熟的BALB/c小鼠的睪丸組織是提取prnd基因的最佳材料選擇。

本研究將目的基因插到質粒pIRES2-EGFP綠色熒光蛋白的啟動子后，與綠色熒光蛋白的基因緊密連鎖，使目的基因和綠色熒光蛋白同步表達，檢測靈敏度高，非常適合基因功能的研究[16-18]。BHK細胞在被甲醇固定時其內質粒載體所帶的綠色熒光猝滅，不影響做IFA時用綠色熒光二抗[19-20]。

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