藥用植物大黃種子基因組DNA的提取方法研究

任海龍

（西藏大學醫學院，西藏拉薩 850000）

大黃（Rheum L.）是蓼科多年生高大草本植物[1]。大黃是一種很常見的中藥材[2]，其功效與作用是很突出的[3]。大黃具有很強的抗感染作用、瀉下作用、保肝作用、退熱作用、治療慢性腎衰竭等用途[4-5]。大黃對根癌土壤桿菌[6]和青霉孢子[7]具有明顯的抑制作用。近年來，對于大黃化學成分的研究相對較多，南海江等[8]對大黃屬植物的有效化學成分進行總結，研究發現，大黃屬植物中有將近200種化學成分；廖華衛等[9]對大黃含片中的大黃酚進行了提取、分離和純化方法的研究；龔云麒等[10]通過各種色譜方法從拉薩大黃乙醇提取物中分離的化合物經現代波譜技術進行了分別鑒定。劉喜綱等[11]對購于北京同仁堂大黃的總蒽醌的提取精制工藝進行了研究，找到了一種相對適合提取大黃總蒽醌的提取工藝。目前在分子方面研究相對比較少，程小麗等[12]對重慶產大黃總RNA提取方法進行了研究，獲得了質量較高的總RNA樣品。而對于DNA提取方面的研究甚少，若要詳細了解其分子機理，最佳DNA的提取方法是必不可少的。

本研究用5種方法對大黃種子基因組DNA進行提取，旨在篩選出最適宜的提取方法，即得到高濃度、高純度的DNA樣品。

1 材料和方法

1.1 材料

大黃種子采于西藏山南瓊結縣（E91°40′，N29°1′），將大黃種子用中草藥粉碎機粉碎，于4℃條件下保存備用。

1.2 方法

將處理保存后的大黃種子樣品分別通過以下5種方法進行基因組DNA的提取。

1.2.1 傳統CTAB法[13]稱取大黃種子粉末50 mg，裝入1.5 mL離心管中，加入500 μL于65℃預熱的緩沖液（0.015 mol/L EDTA（pH 值 8.0），0.075 mol/L Tris-HCl（pH值8.0），1.5%CTAB，1 mol/L NaCl），于65℃保溫30 min，每隔3～5 min輕輕顛倒混勻，使得大黃樣品與提取液充分接觸，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，再加入等體積（由上清液體積決定）的氯仿/異戊醇（24∶1），重復離心至中間無白色物質。取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，于-20℃放置30min；室溫下14000r/min離心17min，去上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.2 改良CTAB法[14-15]稱取大黃種子粉末50mg，裝入1.5 mL離心管中，加500 μL 65℃預熱的提取緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl pH值8.0，0.1 mol/L EDTA pH 值 8.0，0.5 mol/L NaCl，2%CTAB，3%PVP，2%DTT），65℃水浴 30 min，不時顛倒混勻；稍冷卻后，4℃離心10 min，轉速12 000 r/min；取上清，加 500 μL的氯仿 /異戊醇（24∶1），振蕩混勻，轉速12 000 r/min，4℃離心10 min；取上清，加等體積的異丙醇（-20℃預冷），輕輕顛倒混勻，-20℃靜置 30 min；轉速 14 000 r/min，4 ℃離心 30 min。去上清液，70%乙醇洗沉淀2次，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.3 改良SDS法[16]稱取大黃粉末約50 mg，裝入1.5 mL離心管中，加500 μL零度預冷的提取液（50 mmol/L EDTA（pH值 8.0），50 mmol/L Tris-HCl（pH 值 8.0），3%可溶性 PVP，2%DTT），充分混勻后于0℃放置10 min，6 000 r/min離心10 min；去上清液，沉淀中加入500 μL預熱（65℃）的裂解液，混勻后65℃水浴30 min，不時輕輕顛倒混勻；稍冷卻后，加入 500 μL的氯仿 /異戊醇（24∶1），振蕩至出現乳濁狀（或近乳濁狀），于4℃離心10 min，轉速為10 000 r/min，重復2遍；取上清，加入0.25倍體積的無水乙醇和0.11倍體積5 mol/L NaAc溶液（pH值4.8），即刻10 000 r/min離心10 min；取上清，加入預冷的異丙醇（-20℃），-20℃放置30 min；4℃離心10 min，轉速14 000 r/min；去上清液，70%乙醇洗滌2次，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.4 高鹽低pH法[17]稱取大黃種子粉末約50mg，裝入1.5 mL離心管中，加入800 μL于65℃水浴鍋中預熱的提取液[11]（100 mmol/L NaAc，3%可溶性PVP，2%DTT，25 mmol/L EDTA （pH 值 8.0），2%SDS），混勻后65℃保溫30 min，不時輕輕顛倒混勻；冷卻后于4℃離心10 min，轉速10 000 r/min；取上清液，加入2/3倍體積的2.5 mol/L NaAc溶液（pH值4.8），冰上放置15min；然后4℃離心10min，轉速為10 000 r/min。取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），振蕩混勻后4℃離心10 min，轉速為10 000 r/min；取上清液，加等體積的異丙醇（-20℃預冷），充分混勻，-20℃靜置30 min；4℃離心20 min，轉速14 000 r/min，用70%乙醇洗滌，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.5 試劑盒法 植物組DNA提取試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。具體操作過程根據試劑盒提供的說明進行。

1.3 DNA提取液結果檢測

1.3.1 紫外分光光度法檢測 取2 μL DNA提取液稀釋50倍，利用紫外分光光度計測定DNA樣品的濃度，以及在波長260，280 nm處的吸光值，通過其比率可以判斷DNA的純度及提取效果。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 配制0.8%的瓊脂糖凝膠，110 V條件下進行電泳，并用凝膠成像系統進行拍照。

1.3.3 PCR擴增檢測 25 μL體系：ddH2O 15.8 μL 10×Buffer（不含 Mg2+）2μL，MgCl22μL，dNTP2μL，ITS2 F（ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT）1 μL，ITS2 R（GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT）1 μL，Taq 酶 0.2 μL，樣品 DNA1 μL。

PCR反應程序設定：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸45 s，共35個循環；最后72℃延伸5 min。

擴增結果用1.5%的瓊脂糖凝膠在110 V條件下進行電泳，并用凝膠成像系統進行拍照。

2 結果與分析

2.1 5種不同DNA提取方法紫外分光光度法檢測結果

獲得高質量的DNA提取液是對植物樣品進行分子生物學研究的關鍵步驟。本研究采用常用的DNA提取方法（CTAB法、SDS法、高鹽低pH值法和試劑盒法）提取大黃種子基因組DNA。5種不同提取方法均能提取出基因組DNA，但濃度和得率有些差別。經紫外分光光度法檢測，結果列于表1。由表1可知，傳統CTAB法所提取的質量濃度最大，為1 450 μg/mL，其次為改良CTAB法，質量濃度為980，960 μg/mL，高鹽低 pH法居于中間，質量濃度為560，564 μg/mL，而改良SDS法和試劑盒法所提取的DNA質量濃度都比較少，都低于300 μg/mL。5種方法（除試劑盒法外）的A260/A230均小于2.0，說明有殘存鹽和小分子雜質污染。其中，傳統CTAB法和改良CTAB法的A260/A230遠小于2.0，說明小分子雜質特別多。高鹽低pH值法、改良SDS法、試劑盒法的A260/A280均在1.7～1.9，其中，高鹽低pH法為1.82和1.81，最接近1.8，說明只是略有雜質污染；而改良SDS法的A260/A280和A260/A230分別為1.76和1.74，試劑盒法的A260/A280和A260/A230分別為1.72和1.70，它們相對高鹽低pH法雜質略多一點。

表1 5種方法所提取DNA的質量濃度和純度

2.2 5種不同DNA提取方法瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

從圖1可以看出，改良SDS法、高鹽低pH法、試劑盒法在20 000 bp左右均能看到明顯條帶，其中，高鹽低pH法所提取的DNA條帶最亮、最完整、亮度是改良SDS法的2倍，正好與前面濃度比相對應；試劑盒法有條帶但不完整；而傳統CTAB法和改良CTAB法均無明顯條帶，可能是由于CTAB法不適合大黃種子基因組DNA的提取。因此，從圖中可以得出，DNA的量從大到小依次為高鹽低pH法、改良SDS法、試劑盒法、改良CTAB法、傳統CTAB法。

2.3 5種不同DNA提取方法PCR擴增檢測結果

從圖2可以看出，改良SDS法、高鹽低pH法和試劑盒法的PCR檢測效果都很好，條帶在500 bp左右，都可以進行后續試驗。CTAB法沒有條帶，充分證明CTAB法不適合大黃種子基因組DNA的提取。

3 討論與結論

本研究結果表明，CTAB法不適合大黃種子基因組DNA的提??；改良SDS法、高鹽低pH法和試劑盒法提取的大黃種子基因組DNA的純度和完整性都較好，PCR檢測結果也很好，都可以用來進行大黃種子基因組DNA的提取。但改良SDS法所提取的DNA含量太少，時間太長，試劑盒比較昂貴；高鹽低pH法提取的DNA得率最好，時間較短，價格便宜，PCR擴增條帶清晰，能滿足分子標記的要求。另外，由于大黃中含酚類物質比較多，因此，在試驗過程中加入PVP可以更有效地去除酚類物質，得到的DNA純度更高[18]。

對于種子基因組DNA的提取，齊剛等[19]和莊蓉等[20]研究認為，SDS法更適合。而本研究中，在高鹽低pH法基礎上提高SDS含量進行嘗試，取得了不錯的效果。西藏大學生物分子實驗室也進行過燕麥種子基因組的研究，結果發現，高鹽低pH法適合種子基因組DNA的提取[21]。

因此，本研究認為，提取大黃種子基因組DNA的最佳方法是高鹽低pH法。

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