體細胞核移植技術的影響因素

吳 姣，張 麗，霍 永

（ 河南牧業經濟學院 動物科技學院，鄭州 450046）

體細胞核移植是近年來人類在發育生物學和細胞生物學領域所取得的最強大的成果之一，然而該項技術成功率低，技術研究薄弱，因此，分析體細胞核移植技術存在的問題，成為近年來體細胞核移植技術的研究重點。本文分析影響核移植成功率的影響因素。

自1997年英國科學家Wilmut拉開了體細胞核移植時代的序幕以來，先后在小鼠、牛、山羊、豬、貓、兔等動物上獲得成功。盡管體細胞核移植在理論研究和技術完善方面取得了長足的進步，但克隆效率低的瓶頸依然無法突破。

1 供體核影響因素

1.1 供體核的類型

用作供體的體細胞是核移植的主要核心部分，也是影響移植成功率的主要因素之一。自從體細胞核移植技術誕生以來，已經使用過多種類型的體細胞，所使用的體細胞分化程度越低，發育后期胚胎的基因重編程越容易，重組胚的發育潛力越高。目前研究應用比較廣泛的成體細胞是生殖系統的細胞、胎兒成纖維細胞和成體成纖維細胞。卵丘細胞在G0/G1期時處于自然靜止狀態，染色體端粒較短，但細胞內端粒酶活性較高，細胞不會因為染色體端粒的變短而老化。胎兒成纖維細胞來源廣泛，分化程度低，復制速度較快且不易衰老。相對于胎兒成纖維細胞，成體纖維細胞具有取材方便，對消化液比較敏感的優點，且易得到純化的細胞。目前使用尾尖成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、乳腺上皮細胞及心肌成纖維細胞等，都成功取得核移植后代。

1.2 供體核周期

供體核的DNA合成情況與其所處的細胞周期相關，處于G0/G1期的細胞為二倍體核，發生核編程時能夠在第一次細胞分裂的末期維持正常的染色體倍數。許多研究者也支持這個觀點。誘導供體細胞進入G0/G1期階段的方法主要有細胞分選法、血清饑餓法、周期抑制劑、接觸抑制法等，血清饑餓法最為常見。有人認為使用血清饑餓發會引發不同程度細胞凋亡，但大多數結果顯示，經過血清饑餓處理過的供體細胞處于G0期利于重構胚發育。而處于G2/M期的細胞用作供體核，染色質發生成熟前染色質凝集（PCC），很大程度會形成四倍體，經復制形成八倍體染色體，胚胎無法正常發育。

1.3 受體

在早期試驗中，人們嘗試使用卵母細胞、合子、早期胚胎等作為受體細胞用作核移植。研究結果表明，處于MⅡ期卵母細胞作為核受體后期發育情況較佳。MⅡ期卵母細胞胞質被稱為“萬能胞質”，胞質內MPF水平較高，能接受處于各個階段的體細胞核甚至胚胎卵裂球或早期胎兒細胞，能夠有效的構建重組細胞，能支持胚胎的全程發育。

2 卵母細胞的顯微操作

去除卵母細胞的染色體-紡錘體得到卵母細胞胞質作為受體細胞，保證重構胚染色體正常，否則會影響重組胚的發育會受到阻滯。因此，保證重組胚正常發育的條件是得到既完整去除細胞核又減少卵母細胞胞質的損傷。Willad?sen發明了3種去核方法：盲吸法、半卵法、功能性去核法；隨后，人們以Willadsen去核法為基礎，不斷進行創新衍生出紡錘體圖像觀察系統去核法、染色示蹤去核法、化學試劑去核法、點壓法、末期去核法、蔗糖去核法等。

3 重構胚的培養

哺乳動物重構胚在體外培養時，培養液成分不適宜會阻礙胚胎發育。不同動物的培養液成分不同，小鼠胚胎常用CZB、牛羊胚胎多用SOF培養液。單純的CZB或SOF培養液成分簡單，不能提供胚胎早期發育需要的全部能量，添加能量底物（如血清、氨基酸、葡萄糖）可促進胚胎發育。血清作為常用的能量底物可以保持細胞活性并對胚胎的生長發育發揮重要作用，但血清成分復雜，對重構胚發育影響尚有不確定性。除添加能量底物外在培養液中添加輔助細胞（如輸卵管上皮細胞、卵丘細胞等）進行共培養，通過輔助細胞分泌的營養因子有利于促進胚胎發育。其中以輸卵管上皮細胞最常使用，并在豬、綿羊、小鼠等哺乳動物上能顯著性提高早期胚胎的發育率。在胚胎的體外培養系統中，使用共培養系統幫助胚胎渡過阻滯期的效果最為顯著。

4 前景展望

哺乳動物體細胞核移植具有非常廣闊的應用前景，主要表現為：（1）通過核移植技術大量擴增具有優良性狀的個體，大大加速遺傳改良和育種進程。（2）與轉基因技術相結合。生產轉基因動物，通過體細胞核移植技術，簡化了轉基因動物生產環節。（3）利用病人的組織細胞作為供體進行核移植，克隆出早期胚胎培養新的胚胎干細胞系，體外誘導分化后進行疾病治療。（4）其他科學研究，如生產藥用蛋白、保護瀕危物種、培育各種疾病動物模型。隨著這項技術的不斷完善，將會為人類帶來巨大的福利。