強直性脊柱炎患者外周血單個核細胞、血清SPARC表達變化及意義

王麗亞，楊清銳(菏澤醫(yī)學專科學校，山東菏澤74000；山東大學附屬省立醫(yī)院)

強直性脊柱炎(AS)是一種以慢性炎癥為主的全身性疾病，主要累及骶髂關節(jié)和脊柱中軸關節(jié)[1]。富含半胱氨酸酸性分泌蛋白(SPARC)是Termine等[2]在1981年于牛骨中初步鑒定的一種非膠原成分，是一種富含半胱氨酸的小分子糖蛋白，也被稱作骨連接蛋白、基底膜40蛋白(BM40)。SPARC作為一種可由許多細胞分泌的非結構性細胞外間質蛋白，與骨形成、傷口愈合、血管生成和胚胎發(fā)育等均存在密切關系[3]。SPARC可調(diào)節(jié)細胞外基質(ECM)分泌，影響樹突狀細胞遷移和T細胞啟動抗原特異性免疫反應，增加轉化生長因子β(TGF-β)活性，進而抑制免疫炎癥反應[4,5]。Sharma等[6]首先發(fā)現(xiàn)，SPRAC是引起脊柱關節(jié)病的固有免疫系統(tǒng)的組成部分。但目前尚缺乏SPARC與AS關系的相關研究。本研究觀察AS患者外周血單個核細胞、血清SPARC表達變化，并探討其在AS病情進展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年12月～2016年11月山東大學附屬省立醫(yī)院風濕免疫科收治的AS患者70例作為觀察組，男66例、女4例，年齡(33.36±9.39)歲，病程(8.23±6.57)年。患者均符合1984年修訂的紐約AS診斷標準[10]，排除其他自身免疫性疾病、肝臟和腎臟疾病、感染、惡性腫瘤和血管疾病等。選擇同期體檢健康志愿者70例作為對照組，男60例、女10例，年齡(31.01±8.27)歲。兩組性別構成比、年齡具有可比性。本研究通過山東大學附屬省立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核，受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 外周血單個核細胞分離及SPARC mRNA表達檢測 收集兩組空腹肘靜脈血3 mL，采用Ficoll梯度離心法分離外周血單個核細胞，從界面收集細胞，Hank液洗滌3次。加入細胞裂解液，采用TRIzol法提取外周血單個核細胞中的總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，SPARC上游引物：5′-TCGCCTGAGGCTGTAACTGA-3′，下游引物：5′-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3′，引物長度：406 bp；內(nèi)參β-actin 上游引物：5′-GGCTACAGCTTCAC-CACCAC-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTG-GAAGAG-3′，引物長度：212 bp。采用Roche480實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行PCR反應。PCR反應體系：上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，SYBR Green 10 μL，DEPC 7.2 μL，cDNA 2.0 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共39個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法計算SPARC mRNA相對表達量。

1.3 血清SPARC表達檢測 采用ELISA法。收集兩組空腹肘靜脈血3 mL于含有血清分離膠的無菌促凝試管中。靜置半小時后采用離心機1 000 r/min離心20 min，取上層血清，- 80 ℃冰箱保存。采用抗人SPARC ELISA試劑盒檢測血清SPARC蛋白表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 觀察組外周血單個核細胞、血清SPARC表達與病情相關指標的相關性分析 記錄觀察組Bath強直性脊柱炎疾病活動指數(shù)(BASDAI)，并檢測其血細胞沉降率(ESR)及CRP。BASDAI包括疲勞、脊柱痛、外周關節(jié)痛、局限性壓痛以及晨僵持續(xù)時間和程度共6個項目，每個項目10分，6個項目總分除以5即為BASDAI。抽取觀察組晨起空腹肘靜脈血，采用魏式法檢測ESR，免疫比濁法檢測CRP。采用Spearman相關分析法分析觀察組外周血單個核細胞、血清SPARC表達與BASDAI、ESR、CRP的關系。

2 結果

2.1 兩組外周血單個核細胞、血清SPARC表達比較 觀察組外周血單個核細胞中SPARC mRNA相對表達量為22.706±2.704，對照組為24.035±2.590，兩組比較P<0.01。觀察組血清SPARC表達為(1 287.690±486.101)ng/dL，對照組為(1 490.530±503.459)ng/dL，兩組比較P<0.01。

2.2 觀察組外周血單個核細胞SPARC表達與BASDAI、ESR、CRP的關系 觀察組BASDAI為(4.76±1.48)分，ESR為(31.39±18.02)mm/h，CRP為(28.53±15.70)mg/L。觀察組外周血單個核細胞SPARC表達與BASDAI、ESR、CRP均呈負相關關系(r分別為- 0.372、- 0.362、- 0.399，P均<0.01)。

2.3 觀察組血清SPARC表達與BASDAI、ESR、CRP的關系 觀察組血清SPARC表達與BASDAI、ESR、CRP均呈負相關關系(r分別為- 0.285、- 0.332、- 0.560，P<0.05或<0.01)。

3 討論

SPARC是一種能結合細胞外基質中糖和膠原等物質的特殊型分泌性糖蛋白，其本身并不參與細胞外結構組成，而是通過與細胞膜受體、蛋白酶和生長因子等相互作用，調(diào)節(jié)細胞外基質成分、細胞形態(tài)和黏附性，從而發(fā)揮多種生物學活性[7，8，11]。目前發(fā)現(xiàn)，SPARC能夠抑制細胞周期、調(diào)節(jié)細胞分化、抑制某些細胞因子生成；可參與機體炎癥反應、血管生成、傷口愈合、腫瘤遷移等生理病理過程，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[3,6]。研究發(fā)現(xiàn)，SAPRC基因純合子突變與成骨不全癥密切相關，可導致人類發(fā)生嚴重的骨質疏松[12]；成骨障礙患者的成骨細胞中SPARC表達明顯減低[13]。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)，SPARC基因敲除小鼠較野生型小鼠骨密度明顯降低，并且小梁骨骨量丟失更快，說明SPARC是影響骨細胞分化和成骨細胞活性的重要因子。

研究證實，免疫炎癥性反應在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。TNF-α是公認的參與AS發(fā)病的促炎因子之一[15]，其不僅直接參與關節(jié)滑膜組織炎癥反應，也可促進破骨細胞的溶骨作用，增加骨吸收，促進成纖維細胞增生，造成關節(jié)破壞及關節(jié)強直[16]。研究表明，SPARC與TGF-β相互作用，可抑制TNF-α產(chǎn)生，進而減輕體內(nèi)炎癥反應并促進成骨細胞增殖和分化[7]。本研究結果顯示，觀察組外周血單個核細胞、血清SPARC表達均明顯低于對照組，且均與疾病活動指標BASDAI、ESR及CRP呈負相關關系，提示SPARC可抑制AS患者體內(nèi)的炎癥反應，在一定程度上與疾病活動密切相關。許敬人等[16]發(fā)現(xiàn)，提高AS伴骨質疏松患者血清SPARC水平有助于減輕其免疫炎癥反應，同時可改善脊柱、關節(jié)活動功能，增加骨生成，減少骨吸收，最終提高骨密度。

綜上所述，AS患者外周血單個核細胞、血清SPARC表達均降低，SPARC表達檢測有助于判斷患者病情活動，但其具體作用機制尚需進一步研究證實。

參考文獻：

[1] Braun J, Sieper J. Ankylosing spondylitis[J]. Lancet, 2007,369(9570):1379-1390.

[2] Cheng L, Sage EH, Yan Q. SPARC fusion protein induces cellular adhesive signaling[J]. PLoS One, 2013,8(1):53202.

[3] Brekken RA, Sage EH. SPARC, a matricellular protein: at the crossroads of cell-matrix communication[J]. Matrix Biol, 2001,19(8):816-827.

[4] Brune K, Hong SM, Li A, et al. Genetic and epigenetic alterations of familial pancreatic cancers[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008,17(12):3536-3542.

[5] Sangaletti S, Gioiosa L, Guiducci C, et al. Accelerated dendritic-cell migration and T-cell priming in SPARC-deficient mice[J]. J Cell Sci, 2005,118(16):3685-3694.

[6] Sharma SM, Choi D, Planck SR, et al. Insights in to the pathogenesis of axial spondyloarthropathy based on gene expression profiles[J]. Arthritis Res Ther, 2009,11(6):R168.

[7] van der Linden CJ, Breslau PJ, de Jong PC, et al. Prospective study on the incidence of complications of right heart catheterization[J]. Neth J Surg, 1984,36(5):127-129.

[8] Delany AM, Hankenson KD. Thrombospondin-2 and SPARC/osteonectin are critical regulators of bone remodeling[J]. J Cell Commun Signal, 2009,3(3-4):227-238.

[9] Jundt G, Berghauser KH, Termine JD, et al. Osteonectin--a differentiation marker of bone cells[J]. Cell Tissue Res, 1987,248(2):409-415.

[10] Mendoza-Londono R, Fahiminiya S, Majewski J, et al. Recessive osteogenesis imperfecta caused by missense mutations in SPARC[J]. Am J Hum Genet, 2015,96(6):979-985.

[11] Machado DR, Kessler CB, Adams DJ, et al. Accentuated osteoclastic response to parathyroid hormone undermines bone mass acquisition in osteonectin-null mice[J]. Bone, 2008,43(2):264-273.

[12] Sonel B, Tutkak H, Duzgun N. Serum levels of IL-1 beta, TNF-alpha, IL-8, and acute phase proteins in seronegative spondyloarthropathies[J]. Joint Bone Spine, 2002,69(5):463-467.

[13] Azuma Y, Kaji K, Katogi R, et al. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts[J]. J Biol Chem, 2000,275(7):4858-4864.

[14] Zhao YM, Ge LH, Grigoriadis AE. Effect of TNF-alpha on murine osteoclast differentiation[J]. Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2005,37(4):433-435.

[15] 許敬人,張春燕,茅惠明,等.補腎通督方對強直性脊柱炎患者血清TNF-α、TGF-β1及骨代謝的影響[J].上海中醫(yī)藥大學學報,2008，23(1):33-35.

[16] 許敬人,林研,張春燕,等.綜合療法對強直性脊柱炎伴骨質疏松患者血清富含半胱氨酸的酸性蛋白酶的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2013，31(4):466-470.