短穩桿菌懸浮劑對家蠶的毒性與風險評價

林蔚紅，陳偉國，陸水根，楊一平，戴建忠，孫海燕

（1.海寧市蠶桑技術服務站，浙江 海寧 314400； 2.嘉興市綠嘉農業開發有限責任公司，浙江 嘉興 314000）

100億孢子/mL短穩桿菌（Empedobacter brevis）懸浮劑是我國自主創制的新型微生物殺蟲劑，對鱗翅目害蟲有較高的致病致死效果，對人、畜、禽及其他非靶標生物較安全，已登記在蔬菜、水稻、茶樹、棉花、煙草上防治小菜蛾、斜紋夜蛾、稻縱卷葉螟、茶尺蠖、棉鈴蟲、煙青蟲等害蟲［1～2］。浙江省農業廳推薦的2017年主要農作物病蟲草害防治藥劑名單中首次將100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑用于茶尺蠖防治［3］。近年來，各地開展的田間試驗表明短穩桿菌對稻縱卷葉螟、茶尺蠖、菜青蟲的防效良好［4～7］。海寧作為典型的“糧—桑”混栽區，也在探索短穩桿菌微生物農藥防治水稻害蟲的效果。為明確短穩桿菌對養蠶生產的安全性，我們于2017年秋季開展了100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑對家蠶的急性食下毒性和在桑葉上的殘留毒性測定，以評價其在蠶桑地區使用的安全性風險。

1 材料與方法

1.1 供試農藥與家蠶品種

供試農藥：100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑，鎮江潤宇生物科技開發有限公司生產，農藥登記證號：PD20130365；77.5%敵敵畏乳油，南通江山農藥化工股份有限公司生產，農藥登記證號PD85105-2。

供試家蠶：蠶品種為白玉×秋豐，由浙江省海寧市新興蠶種制造有限公司生產。按常規方法飼養至2齡、3齡和5齡，分別供試。

供試桑樹：海寧市蠶桑站試驗桑園，荷葉白品種，12年生，中桿養成，每667 m2桑園栽800株。

1.2 短穩桿菌對家蠶的急性毒性測定

經預備試驗，將100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑稀釋成5～7個等比級差濃度的藥液，取3齡起蠶適用桑葉浸入各稀釋濃度的藥液中1 min后取出，自然晾干后的桑葉放入保鮮盒內，各濃度處理區給入20頭3齡起蠶，在26.5℃±1℃、相對濕度75%～85%的恒溫室內飼養，重復3次，以清水處理為空白對照。添毒24 h后更換成新鮮無毒桑葉，飼養至4齡餉食，每天調查發病死亡率。采用DPS（15.10版）統計軟件對藥液質量濃度對數與家蠶幼蟲死亡率概率值進行線性回歸分析［8］，求出對家蠶的致死中濃度（LC50）和95%置信限。

1.3 短穩桿菌在桑葉上的殘毒期測定

設噴藥濃度和養蠶采葉間隔時間雙向處理組合。參照100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑推薦使用濃度設2種試驗噴藥濃度：500倍（2000萬孢子/mL）和1000倍（1000萬孢子/mL）。噴藥前在桑枝條的頂端成長葉位處做好采葉標記，防止采摘噴藥后新生長的桑葉。

養蠶采葉間隔時間從噴藥后1 d起，每天為一個間隔處理，采摘不同濃度藥液處理的桑葉飼喂3齡起蠶，以無毒桑葉為對照，每小區30頭蠶，重復3次，飼養至4齡，逐日調查記載各小區死亡蠶數量。

1.4 家蠶中毒癥狀觀察

將100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑稀釋成500倍液（2000萬孢子/mL），桑葉在藥液中浸漬約1 min后取出，晾干后分別飼喂3齡蠶和5齡蠶，觀察記錄供試家蠶的中毒癥狀。

1.5 試驗期間天氣條件

殘毒試驗期間天氣：平均氣溫27.1℃，最高氣溫31.4℃，最低氣溫23.9℃，平均日照4.5 h，累計降雨量11.8 mm。

2 結果與分析

2.1 短穩桿菌對家蠶的急性食下毒性與風險性

采用浸葉法測定短穩桿菌對3齡起蠶的急性食下毒性，毒力回歸方程為Y＝-34.6228+5.5649X（相關系數r=0.9937），LC50為1319萬孢子/mL（即100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑稀釋758倍），95%置信限為1234～1436萬孢子/mL。與田間常規使用濃度500～1000倍（2000～1000萬孢子/mL）相比，短穩桿菌對3齡起蠶的毒性比為1.52～0.76，介于中等風險和高風險［9］。

2.2 短穩桿菌在桑葉上的殘毒期

100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑500倍和1000倍稀釋液噴霧處理的桑葉，噴藥后分別間隔1 d～5 d采摘桑葉，從3齡起蠶開始連續飼喂1個齡期，2種濃度藥液處理的桑葉均無致病致死現象。結果表明：在試驗濃度下，100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑在桑葉上的毒性殘留較低，對養蠶無明顯不良影響。

2.3 家蠶的中毒癥狀

100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑500倍液處理的桑葉飼喂3齡蠶，初期食?；菊?，24 h左右開始出現頭胸伸出，靜伏，蠶體麻痹等癥狀，48 h后有少量個體吐褐色污液。飼喂5齡蠶，約24 h有少量吐液，蠶體麻痹、軟癟，靜伏或側倒。3齡蠶和5齡蠶48 h均無死亡，但呈假死狀，中毒后的死亡時間較長。

3 小結與討論

3.1 短穩桿菌對家蠶的急性毒性與風險性

本試驗測定的短穩桿菌對3齡起蠶的急性食下毒性（LC50），因其有效成份計量單位與常規農藥不同，根據LC50無法判定急性毒性等級。采用毒性比評價法，即100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑稀釋758倍（其1319萬孢子/mL的LC50值），與田間推薦使用濃度500～1000倍（2000～1000萬孢子/mL）相比，短穩桿菌的毒性比為1.52～0.76，介于中等風險和高風險。在［10］中，100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑對2齡家蠶的LC50為2200萬孢子/mL（約為供試藥劑稀釋455倍），與本試驗結果相近。

對比孫海燕等［11］47種殺蟲劑對家蠶的毒性比數據，短穩桿菌懸浮劑對家蠶的急性毒性風險較低，僅大于吡蚜酮和樂果。

3.2 短穩桿菌在桑葉上的殘毒期短

100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑500倍和1000倍稀釋液噴霧處理的桑葉，噴藥后分別間隔1 d～5 d采摘桑葉，從3齡起蠶開始連續飼喂1個齡期，均無中毒致病致死現象。表明100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑供試濃度下，在桑葉上的殘留毒性較低。盡管急性食下毒性測定的LC50值介于殘毒試驗2種稀釋濃度之間，但殘毒試驗的高濃度（500倍）處理并沒有出現中毒死亡蠶。可能是兩方面原因所致，一是，急性食下毒性試驗采用浸葉法，而田間殘毒期試驗采用噴霧法，前者接觸藥液更全面，即桑葉上附著的藥物量（致病菌）更多；二是，殘毒期試驗在9月份高溫季節進行，而短穩桿菌在田間應用時受到溫度、濕度和光照等多種環境因素的影響［1］，其藥效和毒性與實驗室測定存在一定差異。杭忠寶等［12］試驗報道100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑12000倍藥液噴灑后18 d的桑葉飼喂4齡起蠶仍有中毒，與本試驗結果相差懸殊。也有報道中提到短穩桿菌懸浮劑對家蠶高毒，蠶室、桑園及其附近禁用［13］。生產企業的產品介紹中100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑對家蠶中毒［10］。可見短穩桿菌對家蠶的毒性及其在桑葉上的殘毒期判定并不一致。

3.3 短穩桿菌對養蠶生產的安全風險

短穩桿菌是從罹病死亡的四齡斜紋夜蛾幼蟲尸體中分離、篩選、純化而來的生物農藥創制新品種，是活體菌，其殺蟲機理是害蟲在取食過程中將足量的短穩桿菌帶進腸胃內，迅速繁殖后產生組織病變致害蟲罹病死亡，因此藥效較慢，一般藥后3 d害蟲死亡率達到高峰［7，14］，同樣，本試驗觀察到100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑500倍對3齡蠶和5齡蠶的致死時間也在3 d左右。本試驗結果表明，100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑對家蠶急性食下毒性和在桑葉上的殘毒均較低，對養蠶生產的安全性風險較低。鑒于短穩桿菌是一種活體菌的特點，有必要深入探討其在自然環境中的繁殖特性及其對養蠶生產的影響。