維生素E和B12對冷凍精子活力和DNA的保護作用

鄭九嘉，陳霞，張李雅，金建遠，楊旭，黃學鋒，費前進

(溫州醫科大學附屬第一醫院生殖醫學中心，溫州 325000)

精子冷凍技術在輔助生育技術中具有重要地位，對于某些重度少精子癥患者的精子保存以及一些患者在進行可能損傷生育力的治療(如需接受放、化療治療的年輕未生育患者)前進行精子冷凍保存，可使患者仍然保留自己生育的權利。因此，精子冷凍保存的研究對于生殖醫學的發展具有重要意義[1]。

利用超低溫保存精子時，在冷凍和復蘇過程中細胞內冰晶的形成和溶液效應造成對精子的損傷，最為明顯的是精子解凍后的復蘇率和活動力下降。由于在凍融過程中會引起精子頭部漿膜廣泛腫脹、破損，精子膜結構不完整率增加，在胞內產生的過量活性氧(ROS)易導致精子DNA、蛋白質以及膜損傷等[2-4]。同時，精子在低溫保存時精漿對精子的保護能力非常有限，因此有必要在凍融過程中通過添加外界有效的物質來保護精子。維生素E(Vit E)是機體中重要的抗氧化劑，其能抑制細胞內一系列ROS的形成，減少和消除ROS對精子的不良作用。Ball等[5]和羅海玲等[6]在馬和羊的精液中添加Vit E后低溫保存，與不添加Vit E的對照組相比，添加Vit E后的精子具有較高的活力和頂體完整率。Vit B12是另一種相對重要的維生素類物質，是目前發現的唯一含有金屬鈷元素的維生素，鈷能夠減少組織的耗氧量，從而提高機體對氧的耐受性，增加機體組織在缺氧環境中的活力。有研究發現，Vit B12作為一種生理活性物質，還具有改善精子外在環境，改進精子活力等作用[7]。本研究主要通過在精子冷凍保護劑中添加適當濃度的Vit E和B12，探索其對精子的冷凍保護作用，為精子的長期有效保存提供一定的理論基礎，也為輔助生殖治療中精子的質量提供保障。

資料與方法

一、研究對象

收集在本中心進行健康體檢的32例正常男性志愿者精液標本，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。受試者禁欲3～5 d，手淫法收集精液標本。所有入選男性經檢查未發現睪丸、染色體、激素水平等異常，同時排除細菌、支原體、衣原體感染等可能影響精子質量的因素，排除器質性及功能性不育患者。

二、研究分組

選取無白細胞污染，精子濃度>50×106/ml且a+b級≥50%的正常標本32例，每1例精液標本分為3份，按添加維生素(添加劑量參照之前文獻[8-9])的不同分為3組：對照組：精液中只添加常規冷凍保護劑；Vit E組：精液中添加常規冷凍保護劑和10 mM的Vit E[8]；Vit B12組：精液中添加常規冷凍保護劑和1.0%的Vit B12[9]。

三、主要方法

1.精子濃度及活動力檢測：收集到的精液標本在37℃ 20～30 min完全液化后按世界衛生組織《人類精液及精子宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》(第5版)行精液常規檢查，采用西班牙MLCRORTICS.L公司的計算機輔助精子自動分析系統(SCA2002)檢測精子濃度和活動力指標。

2.配制含Vit E、B12的精子冷凍保護液：1.5 g葡萄糖、1.3 g檸檬酸三鈉二水加滅菌水至65 ml，加入15 ml甘油和1.3 g甘氨酸，完全溶解后用0.45 μm微孔濾器過濾，加入20 ml新鮮卵黃制成懸浮液，分別添加10 mM Vit E和1.0% Vit B12后于56℃水浴滅活40 min，調整pH至6.8～7.2，在超凈臺中將溶液以2 ml為單位分裝成對照組、Vit E組、Vit B12組，-80℃保存備用。所有試劑均購自美國Sigma公司。

3.精子冷凍及解凍：精子冷凍：冷凍保護劑與精液按1：1混合(Vit E終濃度為5 mM，Vit B12終濃度為0.5%)。室溫平衡10 min，4℃冰箱放置30 min，-20℃冰箱30 min，-80℃冰箱30 min，最后投入液氮(-196℃)保存72 h后復蘇。精子解凍：將液氮中的精液標本取出后立即投入37℃水浴，使之迅速復溫解凍。

4.檢測精子存活率：按照世界衛生組織《人類精液及精子宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》(第5版)[10]推薦的伊紅Y染色法檢測精子存活率。

5.精子染色質擴散(SCD)法檢測精子DNA完整性：SCD檢測采用Halosperm試劑盒(Halotech DNA SL，西班牙)，按試劑盒說明書步驟操作，簡要步驟如下：精液標本調濃度為1×107/ml，60 μl加入溶解的低熔點瓊脂糖凝膠混勻，取20 μl精子凝膠混合液于預處理載玻片上，4℃冰箱水平放置5 min。酸性DNA變性液中室溫避光孵育7 min，避光裂解23 min；去殘余裂解液后依次在70%、90%和100%乙醇中各脫水2 min。晾干后染色10～15 min。400倍光鏡下觀察，比較精子核和核周圍暈輪大小，評價精子DNA碎片率(SDF)。

精子DNA損傷標準：根據暈輪直徑與精子頭部橫徑的比例不同，分為大、中、小和無暈輪4個等級：暈輪直徑/精子頭橫徑≥2/3為大暈輪；1/4 <暈輪直徑/精子頭橫徑<2/3為中暈輪；暈輪直徑/精子頭橫徑≤1/4為小暈輪；觀察不到暈輪為無暈輪。大和中暈輪表示精子DNA完整無損傷；小和無暈輪表示精子DNA有一定程度損傷。

精子DNA暈輪直徑測量：400倍光鏡下不同視野隨即選取50條精子，在顯微測量尺下測量每條精子的暈輪直徑，計算平均暈輪直徑。

6.精子頂體酶活性檢測：使用深圳華康生物醫學工程有限公司的頂體酶試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。正常精子頂體酶活性為48.2～218.7 μIU/106/精子。

四、統計學處理

結 果

一、添加Vit E和B12對冷凍復蘇后精子活動力和存活率的影響

在液氮中冷凍保存72 h的精液標本取出后立即于37℃水浴復蘇，分別比較添加Vit E和Vit B12對精子活動力、存活率及頂體酶活性的影響，發現Vit E組(a+b)%精子數和精子存活率顯著高于對照組(P<0.05)，d%精子數顯著低于對照組(P<0.01)；Vit B12組的(a+b)%精子數和精子存活率有高于對照組的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 3組精子復蘇后精子活動力和存活率比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

二、添加Vit E和B12對冷凍復蘇后精子頂體酶活性的影響

比較3組精子頂體酶活性發現，Vit E組頂體酶活性為(101.8±4.5)μIU/106/精子，Vit B12組為(101.7±4.80)μIU/106/精子，雖然都稍高于對照組的(99.38±4.57)μIU/106/精子，但組間比較無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 3組精子頂體酶活性的比較

三、添加Vit E和B12對冷凍復蘇后SDF的影響

Vit E組和Vit B12組的SDF均顯著低于對照組(P<0.01)，Vit E組和Vit B12組中代表精子DNA完整性的大暈輪精子百分數也顯著高于對照組(P<0.01)，而代表精子DNA發生損傷的小暈輪精子百分數在Vit E和Vit B12組中顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

顯微測量尺下隨機測量精子DNA的暈輪直徑見圖2，Vit E組的精子暈輪平均直徑[(6.76±0.14)μm]顯著高于對照組[(6.09±0.18)μm](P<0.01)，Vit B12組與對照組比較則無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

1：大暈輪精子；2：中暈輪精子；3：小暈輪精子；4：無暈輪精子圖2 精子DNA擴散實驗

討 論

精子冷凍保存技術發展至今已有200多年的歷史，近年來國內外研究均發現，影響人類精子凍融前后效果的主要因素有冷凍方法、冷凍保護劑的成分及凍存時間等[11]。研究表明，經過冷凍解凍處理后精子活動力、復蘇率、頂體酶活性均會受到不同程度的影響，并且會加劇精子DNA損傷，導致精子凍融后質量及受精率的降低[12-13]，這一直是困擾精子受精能力的一個重要問題。精子在冷凍和解凍過程中形成冰晶、產生過量ROS以及精子細胞膜的過氧化反應都會對精子活動力、復蘇率、畸形率、DNA完整性和精卵融合造成不利影響。因此，要提高冷凍精子的能量代謝，獲得較高的精子復蘇率和活動力，必須保護細胞膜的完整和通透性的穩定，這是防止精子冷凍損傷的重要環節。

表2 3組精子復蘇后SDF及暈輪情況的比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

目前普遍認為，精子細胞的凋亡[14]及氧自由基的過量產生[15]是影響精子常規參數和DNA損傷的主要因素。同時，精子DNA被認為是評價精子功能的一項重要指標，精子DNA損傷加劇會降低體外受精中的精子受精能力和胚胎發育潛能，降低臨床妊娠率和增高流產率[16]。精子在冷凍和解凍過程中冰晶的形成會引起細胞結構和功能發生改變，并且該過程中大量ROS的產生使精子細胞膜發生過氧化反應以及對精子DNA完整性造成嚴重的破壞。目前觀點認為，在精子冷凍保護劑中添加適當濃度的維生素可有效減少ROS對精子的不良作用，一些研究也已經證實了這個觀點[17-18]。

Vit E對漿膜的磷脂有著特殊的親和性，能預防或阻止脂質過氧化，使過氧化脂質無法生成，防止精子細胞膜氧化反應的發生，保護精子膜的功能，從而提高精子冷凍后的復蘇率及活動力[17]。一些研究已經證實，通過在精子冷凍保護液中添加Vit E，可使解凍后的精子活動力及DNA損傷得到顯著改善[19]。相對于Vit E在精子冷凍方面的研究，Vit B12在精子冷凍保護方面的研究相對較少。Neild等[20]研究發現，含Vit B12的精漿中谷草轉氨酶(GOT)釋放量明顯下降，這可能是提高精子活動力的一個重要因素，因為在冷凍和解凍過程中，精子中的GOT會釋放出來，從而導致精子的頂體腫脹和損壞，影響精子功能。迄今為止，國內外對Vit B12在人類精子冷凍保護中的作用研究相對較少，僅見一些學者在動物精子冷凍方面的研究，在動物研究中已發現Vit B12對精子冷凍確實有一定的保護作用，在精子冷凍保護液中添加Vit B12，具有維持精子頂體完整率、延長精子體外存活時間和提高解凍后精子活動力的作用[21-22]。

目前，維生素類物質對精子冷凍保護作用主要集中在動物精子的研究以及畜牧業中的應用，在人類精子冷凍保護方面的研究相對較少；同時，在眾多的精子抗氧化冷凍保護劑中維生素的毒副作用相對較小。因此，維生素在精子冷凍保護中的應用研究具有一定前景，對于提高輔助生殖中的精子受精率也有非常重要的意義。本研究分析在精子冷凍保護劑中分別添加適當濃度的Vit E和Vit B12，液氮凍存72 h后復蘇精子的活動力、存活率及SDF等各項指標變化，結果顯示，Vit E能顯著改善復蘇后精子活動力、存活率及DNA完整性；而對于精子頂體酶活性的改善不是很明顯，其原因可能是各組精子均在液氮超低溫環境下保存，而酶主要是由蛋白質構成，超低溫環境對蛋白質的空間結構及活性本身就有很好的保護作用，因此對酶的活性影響較少，單純從頂體酶活性的角度考慮可能無太大差異；而添加Vit B12僅在改善精子DNA完整性方面有較明顯效果，我們推測這與人類精子中的GOT釋放及頂體結構和功能與動物精子存在一定的差異有關；另一方面，本研究納入樣本數較少可能也對研究結果存在一定的影響。

通過本研究，我們初步得出在精子冷凍保護劑中添加適當濃度的Vit E可以緩解凍融過程對精子造成的傷害，在一定程度上提高凍融后精子活動力、存活率及精子DNA完整性；雖然Vit B12組的精子活動力、存活率等指標略高于對照組但組間比較無顯著性差異，提示Vit B12在精子冷凍保護方面的作用尚不明顯。后續，我們將在以上結論的基礎上繼續探索Vit E和Vit B12對人類精子冷凍和復蘇過程的保護作用，尤其是對弱精子癥患者凍融后線粒體呼吸和氧化磷酸化功能的研究，為精子的長期有效保存提供一定的理論基礎，也為實施輔助生殖精子的質量提供保障。

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