串聯質譜法檢測妊娠疾病的氨基酸與酰基肉堿結果分析

劉桂紅，鄧偉楠，陳耀勇，孫筱放，陳敦金，余波瀾

(廣東省產科重大疾病重點實驗室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室，廣州醫科大學附屬第三醫院婦產科研究所，廣州 510150)

代謝組學是研究生物體系代謝途徑的一種技術，主要應用于疾病診斷、藥物代謝、毒理代謝等方面，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后，系統生物學的又一重要研究平臺，并逐漸成為生命科學的研究熱點[1-2]。串聯質譜技術的臨床應用越來越廣泛，尤其在新生兒遺傳代謝病檢測方面，其檢測結果的優勢是準確性好、靈敏度高，特別是在小分子化合物代謝方面的檢測，彌補了其他檢測技術的短板，是目前具有獨特優勢的一種代謝產物檢測技術。妊娠疾病不同于一般內外科疾病，因新陳代謝異常產生的不良代謝產物，可對母體和胎兒造成危害，導致不良妊娠結局。本文重點研究采用串聯質譜技術分析妊娠期疾病患者體內氨基酸和酰基肉堿的表達水平，以期為后續研究代謝產物的作用機制提供思路。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析廣州醫科大學附屬第三醫院產科2015～2016年收治的孕婦78例，按照有無合并妊娠期疾病分為兩組：正常對照組31例、妊娠疾病組47例，妊娠疾病組又根據妊娠期合并疾病的不同分為3個亞組：妊娠期糖尿病組(GDM組)16例、妊娠期高血壓疾病組(HDP組)20例、GDM+HDP組11例。

上述血清樣本采于患者，保存于廣州醫科大學附屬第三醫院生物樣本庫，巢式病例對照研究所需要的樣本均來自于國家重點研發計劃項目所建設的中國產科聯盟妊娠隊列(COACS隊列)。本研究經廣州醫科大學附屬第三醫院倫理委員會審批通過，倫理批號為廣醫2016年(申0406)號，臨床研究注冊號為Clinical Trials NCT03038555。

病例納入、《知情同意書》簽署、樣本采集和臨床隨訪均由專職人員擔任，并保存于廣州醫科大學附屬第三醫院生物樣本庫。所有患者均知情同意，并簽署《知情同意書》。

妊娠疾病組納入標準：(1)孕產婦年齡在20～45歲之間，單活胎，包括自然分娩和剖宮產；GDM組、HDP組、GDM+HDP組入選標準均按照《婦產科學》第8版診斷標準；(2)排除死胎與死嬰、急慢性并發癥(腎病、視網膜病變、心血管和消化道疾病等)。正常對照組的納入標準為：(1)孕產婦年齡在20～45歲之間，無不良孕產史，單活胎，胎齡為37～41周，包括自然分娩和剖宮產；(2)排除產婦妊娠期并發癥、原發性內外科疾病(但乙肝病毒攜帶者肝功能正常者可納入)；(3)產程順利，排除胎兒、胎盤、胎膜、羊水異常或存在胎兒疾病者。

二、試劑與儀器

1.主要試劑：非衍生化多種氨基酸、酰基肉堿測定試劑盒(串聯質譜法)購自廣州豐華生物工程有限公司，檢測18種氨基酸和31種酰基肉堿。檢測項目包括：苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、亮-異亮氨酸(Leu-Ile)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、瓜氨酸(Cit)、組氨酸(His)、鳥氨酸(Orn)、酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)，游離肉堿(C0)、乙酰基肉堿(C2)、丙酰基肉堿(C3)、丁酰基肉堿(C4)、異戊酰基肉堿(C5)、己酰基肉堿(C6)、辛酰基肉堿(C8)、癸酰基肉堿(C10)、十二烷酰基肉堿(C12)、十四烷酰基肉堿(C14)、十六烷酰基肉堿(C16)、十八烷酰基肉堿(C18)、丙二酰基肉堿/3-羥基丁酰肉堿(C3DC/C4OH)、戊二酰基肉堿/3-羥基己酰基肉堿(C5DC/C6OH)、甲基丙二酰基肉堿/3-羥基異戊酰基肉堿(C4DC/C5OH)、異戊烯酰基肉堿(C5∶1)、己二酰基肉堿(C6DC)、辛烯酰基肉堿(C8∶1)、癸烯酰基肉堿(C10∶1)、癸二烯酰基肉堿(C10∶2)、二烯酰基肉堿(C12∶1)、十四烯酰基肉堿(C14∶1)、十四二烯酰基肉堿(C14∶2)、3-羥基十四烷酰基肉堿(C14OH)、十六烯酰基肉堿(C16∶1)、3-羥基十六烷酰基肉堿(C16OH)、3-羥基十六烯酰基肉堿(C16∶1OH)、十八烯酰基肉堿(C18∶1)、十八二烯酰基肉堿(C18∶2)、3-羥基十八烷酰基肉堿(C18OH)、3-羥基十八烯酰基肉堿(C18∶1OH)。

2.儀器：API3200MD型串聯質譜儀購自美國生物應用系統公司(Applied Biosysterms)；Shmazu DGU-20A3型高效液相儀購自日本島津公司；96孔板加熱振蕩裝置采用FWZ-II恒溫微量振蕩器，購自廣州豐華生物工程有限公司。

三、液相色譜串聯質譜檢測方法

1.樣品處理：抽取孕婦外周靜脈血，采用血清標本。配置日常萃取工作液(氨基酸內標∶肉堿內標∶萃取液體積比為1∶1∶108)。樣品經過沉降、干燥、溶解處理。96孔U型板中，樣品60 μl與240 μl甲醇/乙腈(1∶1，V∶V)混合，-20℃靜置10 min，14 000 r/m 4℃離心10 min。離心后取上清15 μl，真空干燥1 300 r/m，60℃，約15 min至溶劑完全蒸發，管內無任何液體。干燥后每孔加入日常萃取工作液100 μl，封片37℃ 750 r/m振蕩30 min溶解萃取。揭膜轉移：取75 μl至V型微孔板。鋁膜覆蓋，即可上樣檢測。

2.儀器設置：流動相采用試劑盒自配非衍生法流動相。四元泵流速設置為 30 μl/min，自動進樣器設置為每次進樣20 μl。每次測定同時采用中性粒子丟失、母離子掃描、多反應監測(MRM)3種掃描方式完成。

3.數據處理：采用軟件ChemoView2.0版本(美國生物應用系統公司)定量處理。

4.質量控制：室內質控品購自廣州豐華生物工程有限公司。1份血清標本做復孔，取兩次檢測結果的平均值。

四、統計學分析

應用SPSS 19.0 統計軟件，非正態分布計量資料以平均秩(Z)表示，多組間比較采用非參數檢驗(Kruskal-Wallis H檢驗)，P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、各組間氨基酸及酰基肉堿檢測情況比較

各組檢測的49種氨基酸及酰基肉堿濃度相比較，其中有12項指標(氨基酸3項、酰基肉堿9項)組間有顯著性差異(P<0.05)，具體如下：Gly、Gln、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1、C14、C16∶1OH；其中有8項指標(氨基酸2項、酰基肉堿6項)在正常對照組的表達水平(平均秩)顯著低于妊娠疾病組(P<0.05)，具體如下：Gly、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC。其余37項指標組間比較無顯著性差異(P>0.05)。數據結果詳見表1～2。

表1 18種氨基酸測定含量的組間比較(Z，單位：μmol/L)

注：組間比較，*P<0.05

注：組間比較，*P<0.05

二、GDM組與對照組中氨基酸及酰基肉堿檢測情況比較

多組間Kruskal-Wallis H檢驗結果顯示，12項有顯著性差異的指標中，GDM組中表達水平顯著高于對照組的有氨基酸3項和酰基肉堿6項，具體如下：Gly、Gln、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC。GDM組表達水平顯著低于對照組的有酰基肉堿3項(C8∶1、C14、C16∶1OH)。

三、HDP組與對照組中氨基酸及酰基肉堿檢測情況比較

根據多組間Kruskal-Wallis H檢驗，HDP組中表達水平顯著高于對照組的有氨基酸2項和酰基肉堿8項，具體如下：Gly、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1、C14。HDP組中表達水平顯著低于對照組的有2項(Gln、C16∶1OH)。

四、GDM+HDP組與對照組中氨基酸及酰基肉堿檢測情況比較

多組間Kruskal-Wallis H檢驗結果顯示，GDM+HDP組中表達水平顯著高于對照組的有氨基酸3項和酰基肉堿7項，具體如下：Gly、Gln、Trp、C3、C3DC/C4OH、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1。GDM+HDP組中表達水平顯著低于對照組的有酰基肉堿2項(C14、C16∶1OH)。

五、GDM組與HDP組中氨基酸及酰基肉堿檢測情況比較

HDP組中表達水平顯著高于GDM組的指標有氨基酸2項和酰基肉堿7項，具體如下：Gly、Trp、C3、C4、C5、C6、C6DC、C8∶1、C14。HDP組中表達水平顯著低于GDM組的指標有3項(Gln、C3DC/C4OH、C16∶1OH)。

六、GDM+HDP組、GDM組、HDP組中氨基酸及酰基肉堿檢測情況比較

GDM+HDP組中表達水平顯著高于GDM組和HDP組的指標有氨基酸2項和酰基肉堿3項(Gly、Gln、C3DC/C4OH、C5、C6)，顯著低于GDM組和HDP組的有氨基酸1項和酰基肉堿4項(Trp、C3、C4、C6DC、C8∶1)。GDM+HDP組中表達水平均顯著低于GDM組和HDP組的有酰基肉堿2項(C14、C16∶1OH)。

討 論

生命的新陳代謝是一個復雜的系統過程，正常人血中游離氨基酸、游離脂肪酸、有機酸的水平處于動態平衡中。為了滿足胎兒和母體的營養需求，妊娠期間新陳代謝會發生復雜的變化。然而，妊娠期間的高血壓疾病、糖尿病因涉及到復雜的病理生理過程，導致體內的新陳代謝發生異常變化，嚴重影響了母嬰健康。近幾年，已有研究報道游離氨基酸及脂肪酸的水平變化與高血壓病、糖尿病之間的相關性[3]，游離脂肪酸與代謝性疾病之間的關系[4]，認為游離脂肪酸的代謝異常在胰島素抵抗(IR)、高胰島素血癥、高血壓病、2 型糖尿病等發病過程中具有非常重要的作用。盡管酰基肉堿是脂肪酸、有機酸代謝的中間產物，但較少學者研究妊娠疾病中孕婦外周血中氨基酸和酰基肉堿的表達水平。

國外Lindsay等[5]報道健康妊娠期間幾種必需氨基酸和非必需氨基酸、長鏈多不飽和脂肪酸、游離肉堿、乙酰肉堿、磷脂酰膽堿和鞘磷脂的母體血漿濃度顯著降低。本研究運用液相色譜串聯質譜技術研究HDP組、GDM組、GDM+HDP組孕婦體內49種氨基酸及酰基肉堿的含量水平，與正常對照組比較，氨基酸或酰基肉堿濃度增加，提示HDP、GDM與氨基酸或酰基肉堿的代謝失衡關系密切。

有研究將原發性高血壓患者與健康受試者的代謝狀態進行比較，發現原發性高血壓患者血漿中3-甲基組氨酸、甘氨酸、鞘氨醇等濃度顯著升高，而門冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等濃度顯著下降[6]。結合本研究結果，我們分析表明原發性高血壓和HDP中氨基酸代謝的種類變化不一致，推測妊娠因素決定了兩者之間的氨基酸代謝發生變化的機制不一致，進而影響了氨基酸代謝水平的差異。董愛華[7]的碩士學位論文報道，HDP組血清游離脂肪酸水平升高，這為本研究HDP組的酰基肉堿水平比正常對照組呈現升高趨勢的實驗結果，提供了一定的“橋梁”價值。同時，Odibo等[8]研究表明妊娠期氨基酸和酰基肉堿代謝組學的測定篩選在先兆子癇中具有潛在的預警生物標志物的作用。

Weng等[9]研究表明在糖耐量受損并高血壓病的白種人和非裔美國人中，氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的血漿水平與代謝綜合征相關。Rahimi等[10]研究表明氨基酸(精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸)的水平與GDM風險相關，Chorell等[11]研究表明GDM的支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)水平顯著提高。國內汪思陽等[12]亦對2型糖尿病患者中血漿氨基酸變化特點進行了研究。結合本研究表明，無論是2型糖尿病，還是GDM，其氨基酸含量水平呈升高趨勢；兩者疾病之間是否存在共同代謝途徑的異常機制尚不完全清楚。Nevalainen等[13]研究表明氨基酸或酰基肉堿的血清水平在孕早期GDM中存在顯著差異，是重要的預測標志物。

本研究表明妊娠期間高血壓疾病、糖尿病，在妊娠因素、不同疾病的影響下，機體內氨基酸或酰基肉堿的代謝水平有差異。同一疾病的氨基酸或酰基肉堿變化的種類報道不一，這可能與不同的人群種族特異性表型、代謝組學研究方案和檢測方法不一致有關，需要流行病學方法進一步研究分析。氨基酸或酰基肉堿含量水平的升高是否作為妊娠期間的高血壓疾病、糖尿病的危險因素和早期預警生物標志物，有待于進一步深入探討研究。

目前氨基酸和酰基肉堿代謝途徑的異常機制尚不完全清楚。Cooper-Dehoff等[14]報道評估了異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的代謝水平與支鏈氨基酸轉氨酶1(BCAT1)和苯丙氨酸羥化酶(PAH)的單核苷酸多態性、糖耐量受損發展的關系。Ho等[15]在口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)檢測前后進行110種代謝物分析，證實氨基酸、糖異生和各種氧化還原反應等的代謝途徑受胰島素作用影響。Berti等[16]研究妊娠母體營養和后代健康有關的生物化學機制以及它們在胎盤中的轉運和利用。基于之前研究報道，我們推測HDP或GDM的氨基酸或酰基肉堿水平的代謝變化機制與BCAT1和PAH的單核苷酸多態性、胰島素作用、胎盤營養代謝和胎兒轉移蛋白合成功能有關。

本實驗的不足之處是樣本量較小，可能會對結果造成一定的偏倚，后續應進一步擴大樣本量和對基線資料分析，控制混雜因素，以進一步探討和驗證現有結論。

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