玉米單倍體加倍技術的研究進展

張培風 ，王長彪 ，趙興華 ，劉 江 ，韓 斌 ，路貴和

（1.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西 太原 030031）

玉米具有遺傳和基因組工程開發的悠久歷史，被認為是21世紀應用較廣泛的高等植物之一[1]。玉米作為我國種植面積廣泛的第三大糧食作物，在工業上供可開發產品數量多且運用較廣[2]。但是近些年來，由于耕地面積減少，環境日益惡化，選育優質玉米品種已成為育種界重中之重。近年來，國內外對玉米單倍體加倍技術進行了大量研究，國外一些公司已開發操作簡單、效率較高的技術并進行大規模應用[3]，而我國玉米單倍體加倍技術的研究仍處于起步階段，在一定程度上通過誘導得到的單倍體種子加倍率較低，進一步限制了我國玉米單倍體加倍技術在育種中的實施和進步。因此，為了獲得操作簡便、成本較低、加倍率高的加倍技術方法，我國研究人員進行了大量的研究。目前，我國主要采用的加倍技術有自然加倍法、秋水仙堿和除草劑等試劑化學加倍法。

筆者主要根據近幾年對玉米單倍體化學加倍技術的研究進展進行探討，旨在為科研人員探究玉米單倍體加倍技術提供參考。

1 獲得玉米單倍體的方法

1.1 利用品種間雜交獲得單倍體

利用植物品種間、自交系間進行雜交，使植物染色體發生異常，產生單倍體。染色體異常主要表現在假配生殖，而假配生殖主要是指異源的精子在沒有與卵細胞融合的條件下，直接在細胞質內發生解體，未經受精的卵細胞繼續發育形成單倍體。如母本白菜型油菜與父本甘藍型油菜雜交，可誘導父本染色體組通過孤雌生殖產生單倍體[4]；黃茄和龍葵之間雜交也可發生假配生殖產生龍葵單倍體[5]。但有研究表明，這種利用品種間雜交獲得單倍體的發生頻率較低，難以滿足科研和育種的需要。

1.2 花藥離體培養單倍體

依靠花藥離體培養單倍體的一般過程是：取孕穗期的玉米雄穗，在無菌條件下剝取花藥置于誘導培養基上培養，待獲得胚狀體后，再轉接到分化培養基上，得到新的植物。該方法便于染色體加倍，但整個過程通過組織培養進行，主要原因是：第一，愈傷組織誘導率在基因型之間差異大；第二，愈傷組織分化的不確定性；第三，愈傷組織培養過程中容易發生體細胞變異，如基因突變、染色體結構變異、倍性和異倍體變異等；第四，通過組織培養獲得的單倍體，由于實驗環境要求高，操作較為復雜，花藥離體培養在單倍體育種中運用受到限制[6]。因此，探究更完善的花藥離體培養技術成為育種工作者研究的課題。

1.3 輻射誘變或化學誘導單倍體

輻射誘變主要是將輻射處理后的花粉對去雄的母本進行授粉，產生單倍體。在小麥、玉米等作物上均有利用物理和化學因素誘導單倍體的報道[7]。例如，PETOLINO[8]用X射線照射小麥花粉授粉，后代中獲得了17.58%的單倍體植株；RANDOLPH[9]采用5個不同玉米材料，經X射線處理花粉授粉，產生的孤雌生殖單倍體頻率平均可達0.096%，比相應對照平均提高50%。然而，通過物理和化學產生誘變的劑量和濃度都需要研究，而且利用輻射和化學方法需要在嚴格隔離的環境下進行操作。因此，輻射和誘變誘導單倍體的方法具有較大的局限性。

1.4 誘導系誘導單倍體

目前，獲得單倍體最常用的方法是利用誘導系誘導產生單倍體。1959年，COE[10]以Stock6為父本，與其他雜交系誘導及授粉產出1%～2%的母本。KERMICLE[11]研究表明，以 W23（ig）系母本參照物發生雜交可產出0～2%的父本單倍體。由于利用誘導系產生單倍體具有誘變頻率低和與另一親本雜交容易受限制的缺點，國內外很多育種家對其進行了研究和改良。法國農業科學院[12]從W23和Stock6雜交品種中選育出了3.5%的誘導孤雌生殖株；CHALYK 等[13-14]使用 ZMS 改良出的 MHI，KMS，可引起超過3%的胚胎誘導。在我國，吉林省農業科學院才卓等[15]通過M278對Stock6進行不斷改良，選育出了吉高誘3號；吉林農業大學相關研究人員通過利用吉高誘3號、Stock6等誘導系改良出了一系列高誘導率誘導系[16]，這些誘導系的成功選育，加速了玉米單倍體育種技術在我國的應用。

除此以外，獲得玉米單倍體的方式還包括植物自發產生法、遠緣雜交法、X射線和紫外線法等[17-18]。

2 單倍體的鑒定

2.1 田間形態觀察法

該方法是在田間對單倍體形態進行鑒定。總體上，玉米單倍體植株生長緩慢，葉片直立，葉窄，葉色較淺，株高和穗高顯著低于非單倍體。非單倍體是由誘導物產生的二倍體種子，具有一定的雜種優勢和旺盛的生命力，與雜交種植株存在著明顯的差異，因此，在6葉期左右就能區分單倍體和非單倍體。這也是鑒定玉米單倍體的重要依據。

2.2 利用分子標記鑒定

該方法是利用分子標記技術對雜交組籽粒基因型進行鑒定，在操作過程中雖然不受外界條件和植株發育階段的限制，但成本較高。因此，生產上大規模應用比較困難。

2.3 利用流式細胞儀檢測

利用流式細胞儀對玉米植株細胞處于分裂間期的DNA含量進行檢測，根據DNA含量所呈現的峰值圖對玉米單倍體植株進行鑒定，該方法較準確、快速，但無法對種子進行倍性鑒定。此外，由于儀器昂貴、技術要求高，因此，在田間育種的廣泛應用受到極大限制。

2.4 利用遺傳標記法篩選

Rl-nj基因最早存在于誘導系Stock6中[19]，可根據該基因在玉米胚乳粉糊層和胚的盾片中是否表達紫色花青素這一特性將誘導系的后代進行區分。目前，利用這一存在誘導系間的Rl-nj基因，可對較大量非單倍體進行淘汰[20]，但是由于該基因表達強度會受很多因素影響[21]，以及在母本受體攜帶Rl-nj基因或抑制基因時，該方法未得到廣泛應用。為使得技術更完善，育種家在誘導系中通過整合的基因，借助在玉米莖稈和根系等器官表達的特點，對非單倍體植株進行篩選和淘汰，但某些較特殊的單倍體如黃綠苗基因作為遺傳標記對單倍體進行篩選，會受到材料遺傳背景的極大限制，無法成為主要的鑒定方法。

3 單倍體的自然加倍

單倍體的自然加倍主要是指在沒有人為干預條件下使植物細胞的有絲分裂無法正常進行。CHASE[22]研究表明，玉米單倍體一代的自然加倍可控制在10%左右。CHALYK等[23]研究發現，玉米雌穗恢復二倍化的機制高于雄穗。此外，玉米基因型、單倍體細胞的核內復制、分裂等因素都會影響單倍體自然加倍的產生[24]；種植季節和地點也會影響單倍體的自然加倍。有研究表明，由于生長前期溫度較低、溫差較大，春季播種的玉米較夏季播種更有助于自然加倍的發生；段民孝等[25]研究發現，甘肅地區的春播和海南地區的冬播較北京春播玉米發生自然加倍的概率高。蔡泉等[26]研究發現，海南地區玉米單倍體的自然加倍率遠高于黑龍江地區。

4 單倍體的化學加倍

4.1 秋水仙素加倍法

玉米單倍體自然加倍法具有操作簡便、安全無害的特點，但加倍率較低，因此，要想要提高加倍效率，必須人為對其進行處理。其中，最常見的是秋水仙素加倍法，而利用秋水仙素作為最常用的化學加倍方法主要包括浸種法、浸根法、注射法和浸芽法。

4.1.1 浸種法 先用凈水浸泡種子24 h，再用不同濃度梯度秋水仙素溶液進行處理，最后經流水沖洗后進行播種。1994年，GAYEN等[27]用不同時間段和不同濃度的秋水仙素對浸泡過的胚芽切口的單倍體進行處理，結果表明，秋水仙素在濃度為0.06%、處理時間為12 h時，加倍率可達18%，效果最佳。

4.1.2 浸根法 對處在幼苗期的單倍體根系，用一定比例的秋水仙素配比液浸泡一段時間，然后再用清水進行沖洗，最后將經過處理的幼苗移栽至田間，進行加倍情況的觀察和統計。1955年，SEANEY[28]通過觀察浸泡在0.05%秋水仙素溶液中單倍體的幼苗24 h移栽后發現，18株單倍體中有12株部分雄花能散粉，而12株對照中只有3株散粉。文科等[29]采用浸根法，將發芽5～7 cm的單倍體種子固定并浸泡于一定比例的秋水仙素溶液中，結果表明，秋水仙素溶液濃度為0.02%時，加倍效果最佳。但該方法進行育苗、處理、移栽等工作繁瑣，所需劑量較大，成本高，移栽后不能充分保證苗木成活率。

4.1.3 注射法 注射法需要借助注射器將配好的秋水仙素溶液對單倍體進行注射。1952年，CHASE等[30]利用甘油水溶液和秋水仙素注射玉米單倍體的盾片節，獲得了一定數量的結實率。此外，魏俊杰等[31]采用高誘1號為父本，將不同濃度的溶液分別與二甲基亞砜（DMSO）進行配比，然后在6葉期時對幼苗的莖尖進行注射，結果發現，秋水仙素濃度為0.5%時，效果最顯著。該方法不需育苗和移栽，操作簡便且用量少，適于大批材料，但由于植株間存在差異較大，注射部位不易辨認，因此，對注射的技術要求比較高。

4.1.4 浸芽法 該方法是將單倍體幼芽浸泡于秋水仙堿中進行處理。EDER[32]用不同濃度的秋水仙素溶液在不同時期進行浸芽處理，可以得到27.3%的結實率。蔡泉等[33]通過浸芽法對單倍體處理發現，濃度在0.06%時的平均存活率可達71.6%，平均加倍率為21.8%。岳堯海等[34]將0.05%秋水仙素、5%二甲基亞砜混合藥劑浸泡9 h，溫度控制在15℃以下，加倍率可達38.1%，效果最佳。綜合比較，浸芽法的加倍率可達30%以上，是一種較為有效的加倍方法，但該方法處理程序復雜、對田間管理要求比較高，若管理不佳，幼苗的存活率則會降低。該方法操作過程中所需秋水仙素溶液較多，因此，需要做好充分的防毒工作。

4.2 除草劑加倍法

秋水仙素毒性較大，很容易造成死苗、畸形等情況，因此，科研人員開始尋找其他替代品，篩選出一些具有類似功能的抗微管除草劑。目前，比較常用的抗微管除草劑包括：氟樂靈、拿草特、甲基胺草磷等。WAN等[35]研究表明，甲基胺草磷、拿草特與秋水仙素能用于誘導花粉愈傷組織的加倍，但無法對體細胞的突變加以提高。WAN[36]采用除草劑對玉米花藥愈傷組織實現加倍處理，結果發現，幾種除草劑產生了不同的加倍效果。慈佳賓等[37]采用氟樂靈、拿草特2種除草劑對玉米單倍體進行處理，結果發現，浸種法氟樂靈濃度為80 μmol/L處理20 h時，加倍率最高（37.6%）；浸芽法拿草特在濃度為6 μmol/L處理24 h時，加倍率最高（24.8%）；浸根法氟樂靈40 μmol/L加倍率最高（16.9%）。通過不同處理表明，氟樂靈浸種法對玉米單倍體加倍效果較好。

5 展望

利用單倍體加倍技術，可以縮短玉米育種年限，加快育種進程。單倍體的自然加倍在加倍方法中操作簡便，但自然加倍的效率較低。因此，在實際工作中，秋水仙素作為高效加倍劑已被玉米單倍體加倍廣泛使用，但秋水仙素毒性大、加倍后容易產生畸形苗，因此，尋找可代替秋水仙素的試劑成為今后工作的重點。總之，尋求高效率的加倍技術方法，需要更好地完善單倍體誘導體系、發揮單倍體加倍技術，從而提升玉米在國內外市場的競爭力。

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