體外模擬消化液對金釵石斛的作用

梅娜娜，婁在祥*，王洪新*，寇興然，孟映霞

（江南大學食品學院，國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122）

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）莖部表面金黃色或者帶綠色，有深縱溝。質硬而脆，斷面平坦而疏松；氣微、味苦，是常用名貴中藥材，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物。其中主要含有多糖、生物堿、酚類和鞣質類等化學成分[1-3]。研究發現金釵石斛具有降血糖血脂[4-5]、抗腫瘤[6]、治療白內障[7]和護胃[8]等功效[9-10]?！侗静菥V目》記載其“久服，厚腸胃，補內絕不足，平胃氣”?！吨腥A人民共和國藥典》（2015版）記載其具有“益胃生津，滋陰清熱”之功效。研究表明，在抗腫瘤和對心血管、胃腸道抑制及止痛退熱等方面生物堿起著重要的作用，2000年日本學者Morita等[11]發現從金釵石斛中分離得到的Picrotoxane倍半萜型生物堿Flakinins A和B以及Mubironine C具有減輕小鼠白血病L1210細胞毒性的作用，體外半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）分別為4.0、8.5、2.6 μg/mL。陳曉梅等[8]研究發現石斛堿能抑制離體兔腸管活動，推測這是由于石斛能使血中胃泌素濃度升高；石斛通過直接刺激G細胞，引起胃泌素的釋放增加，使血清中胃泌素的濃度升高，而胃泌素刺激壁細胞，使胃酸分泌增加，從而明顯降低小鼠胃腸推動作用。鐵皮石斛多糖能夠顯著提升小白鼠外周白細胞數和促進淋巴細胞產生移動抑制因子，并且能夠強有力地消除實驗條件下免疫抑制劑環磷酰胺加入所引發的副作用，是一種高價值的中藥類免疫增強劑[12]。金釵石斛多糖具有直接促進淋巴細胞有絲分裂的作用[13]。石斛中所含有的石斛酚、杓唇石斛素、1,3-苯二醇、5-[2-（4-羥基-3-甲氧基苯基）乙基]（苷類）、玫瑰石斛素、4-羥基-3,3’,4’,5-四甲氧基聯芐、2,4,8-三甲氧基菲-3,7-二醇、毛蘭菲、4-甲氧基菲-2,5-二醇、皮樹脂醇和丁香脂素等酚類化合物具有抗氧化活性，對三價鐵硫氰酸鹽的抗氧化活性高于丁基羥基茴香醚[14]。

Gullon等[15]用體外模擬消化方法研究了副產品石榴皮粉體外消化液中總酚及總黃酮類物質的穩定性，并得出經體外模擬消化液消化后總酚物質的含量降低，除鞣花酸含量有所增加。袁春龍等[16]利用體外模擬消化液對葡萄籽超微粉進行消化，同時測定多酚類物質和白藜蘆醇溶出率。結果表明，多酚、白藜蘆醇的溶出率分別為：霞多麗60.87%～67.43%、23.65%～40.64%；赤霞珠60.48%～69.99%、20.63%～43.38%。經模擬腸液消化5～15 h后，多酚、白藜蘆醇的溶出率分別為：霞多麗1.96%～17.86%、17.51%～50.25%；赤霞珠3.38%～15.23%、14.02%～44.71%。葡萄籽中多酚物質的消化吸收主要集中在胃環境中，而白藜蘆醇在腸、胃環境中的消化吸收幾乎各占一半。張冠亞等[17]采用3 種體外模擬消化液對鐵皮石斛多糖進行體外模擬消化研究，結果表明，在體外模擬胃腸道的消化體系中，鐵皮石斛多糖的分子質量減小，糖苷鍵發生斷裂，但沒有游離單糖的釋放。然而有關采用模擬胃腸道消化過程來比較研究金釵石斛功能性成分被人體吸收情況鮮有報道；因此，本實驗模擬口腔、胃、腸環境條件，體外模擬消化金釵石斛全粉（超微粉/普通粉）、提取物（水提物/醇提物）的消化過程，探究金釵石斛中石斛堿、多糖和其他化學成分（多酚類）在體外模擬消化過程中含量的變化和多糖消化產物，為今后探索金釵石斛功能性的動物實驗和金釵石斛保健產品的開發和應用提供實驗參考。

體外模擬消化道的實驗方法在了解食品或者藥物胃腸運行狀態中應用廣泛。盡管人體營養研究仍是全球普遍采用的方法，但是體外實驗具有成本低、快速、便捷和無倫理限制的優勢。體外模擬消化的方法包括口腔、胃部和小腸部分，偶爾包括大腸發酵部分[18]。體外模擬消化方法中，研究者嘗試著模仿生理學的條件，其中考慮到的因素有消化酶及其濃度、pH值、消化時間、鹽濃度和其他因素[19-20]。因此，本實驗以人體胃、腸道模擬系統為基礎，并加以適當改進[21]，希望探索出金釵石斛化學成分在體內的消化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金釵石斛（莖部）由貴州赤水金釵石斛國禮發展有限公司提供。金釵石斛超微粉（submicron powder，SP）（500 目）由濟南納力德超微粉碎技術公司制得。普通粉（common powder，CP）、水提物（water extract，WE）、醇提物（alcohol extract，AE）、粗石斛堿（dendrobine，D）和粗多糖（polysaccharide，P）均由江南大學食品營養與功能因子實驗室自制。

淀粉酶（10 U/mg）、胃蛋白酶（40 U/mg）美國Sigma公司；胰酶、豬膽粉、黏蛋白 上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、硝酸銨、磷酸鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、尿酸鈉、乳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純；巖藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖的標準品 國藥集團化學試劑有限公司；蕓香葉苷、綠原酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、熊果酸、芹菜素、沒食子酸、槲皮素的標準品 上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GC7890氣相色譜儀 美國安捷倫公司；UV-1800型紫外分光光度計 日本島津公司；AR224CN電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；BS-1E溫控搖床 瑞華儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司；TGL-16C臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；超高效液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀（ultra-high performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry，UPLC-TQD-MS）美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 金釵石斛全粉、提取物、粗石斛堿及粗多糖的制備

1.3.1.1 金釵石斛超微粉和普通粉的制備

金釵石斛莖鮮品→去葉、清洗→切段（4～5 cm）→熱風干燥（水分低于5%）→粉碎（過60 目）→普通粉→包裝備用。超微粉由普通粉經超微粉碎機進一步粉碎制得（500 目）。金釵石斛超微粉和普通粉主要為石斛全粉。

1.3.1.2 金釵石斛水提物和醇提物的制備

水提物：稱取金釵石斛干粉160 g，加入3.2 L超純水，于70 ℃條件下提取2 h后紗布濾過，共提2 次。8 000 r/min離心10 min，再于65 ℃條件下真空旋轉蒸發濃縮。濃縮后真空干燥得水提物，主要成分為水溶性成分。

醇提物：稱取金釵石斛干粉120 g，加入2.4 L體積分數95%乙醇，按照上述水提物制備方法操作，得醇提物備用，主要成分為醇溶性成分[22]。

1.3.1.3 金釵石斛多糖和石斛堿的提取分離

多糖：向金釵石斛干粉中加入體積分數95%乙醇，在75 ℃條件下攪拌脫脂2 次。經過濾后向所留殘渣中加入9 L超純水，70 ℃條件下提取2 h，共提2 次。紗布過濾后8 000 r/min離心10 min，再于65 ℃條件下真空旋轉蒸發濃縮。然后向濃縮后的膠狀溶液里加入4 倍體積的純乙醇，加入的過程中不斷攪拌。4 ℃條件下靜置24 h后，8 000 r/min離心10 min后取沉淀，并用純乙醇、丙酮和乙醚進一步沖洗。最終將沉淀物凍干，得到粗多糖[23]。主要成分為粗多糖。

石斛堿：向金釵石斛干粉中加入體積分數95%乙醇4 L，75 ℃條件下提取2 h，共提2 次。紗布過濾后8 000 r/min離心10 min，再于65 ℃條件下真空旋轉蒸發濃縮。濃縮后進行真空干燥得粗生物堿備用。將粗生物堿溶于體積分數30%乙醇，8 000 r/min離心5 min后取上清液，用氯仿萃取所得上清液2 次，真空干燥萃取物。經大孔樹脂AB-8對石斛堿進行純化，最后用氣相內標法測定石斛堿含量。測得所制石斛堿質量分數為73%。

1.3.2 口腔模擬消化

將體外模擬消化實驗分成金釵石斛超微粉、普通粉、水提物、醇提物、粗石斛堿和粗多糖共6 個組，分別記作SP、CP、WE、AE、D和P組。同時各組分成口腔、胃部和腸道3 個組。

人工唾液的配制按照表1所示方法進行制備[24]。根據文獻[24]報道5 g/L黏蛋白可以有效模擬人類口腔的黏度，因此實驗選取黏蛋白的質量濃度為5 g/L。加入淀粉酶使其濃度為150 U/mL。將配制好的人工唾液用0.1 mol/L鹽酸或者氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8。取50 mL離心管，加入5 mL人工唾液，分別與一定量的金釵石斛超微粉、普通粉、水提物、醇提物、粗石斛堿及粗多糖充分混合后放入搖床，37 ℃、100 r/min條件下振動15 min。

表1 體外消化中人工唾液各類化學組分組成[24]Table1 Chemical composition of artificial saliva used in the in vitro digestion model[24]

1.3.3 胃液模擬消化

將裝有經口腔消化后樣品的50 mL離心管取出，分別加入按表2配制好的人工胃液10 mL，充分混勻后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至2.5，放進搖床中于37 ℃、100 r/min條件下繼續振蕩2 h。

表2 體外模擬消化中人工胃液的化學成分組成[25]Table2 Chemical composition of artificial gastric fluid (SGF) used in the in vitro digestion model[25]

1.3.4 腸液模擬消化

腸液模擬消化參照文獻[19]。人工腸液的配制（20 mL）：按照5 mL胰酶（5 mg/mL（以胰蛋白酶活力計））、2.5 mL豬膽粉溶液（8 mg/mL）、40 μL氯化鈣溶液（0.3 mol/L）、0.15 mL 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）和12.31 mL水的組成配制人工腸液。將經模擬胃液消化完的樣品從搖床中取出，按照20 mL胃腔樣品與20 mL人工腸液混勻。最后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0，放進搖床中于37 ℃、100 r/min條件下繼續振蕩2 h。

在模擬唾液、胃液和腸液3 步消化后，分別將消化液混合物在4 ℃條件下5 000 r/min離心5 min，取上清液。各個實驗組分別定容至50 mL備用。

1.3.5 金釵石斛石斛堿和多糖溶出率的計算

各組消化液（P組除外）中石斛堿含量的測定：取一定量消化液于離心管中，后加入等量氯仿萃取，重復2 次后收集有機相，旋蒸后甲醇定容，加入內標萘后采用氣相色譜儀按照《中華人民共和國藥典》（2015版）中金釵石斛堿的測定方法進行。

各組消化液（AE、D組除外）中多糖含量的測定：取一定量消化液于離心管中，加入4 倍體積無水乙醇，混勻經醇沉冷藏1 h后，5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入無水乙醇振蕩離心吸去雜質，重復上述步驟2 次。將沉淀的多糖用熱水定容后，參考藥典中鐵皮石斛多糖的測定方法（苯酚-硫酸法）進行測定，溶出率按下式計算。

式中：ρ1為消化后上清液中石斛堿或多糖的質量濃度/（mg/mL）；ρ2為消化前原料中石斛堿或多糖的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 金釵石斛粗多糖消化產物的測定

將粗多糖配成2 mg/mL的溶液，按照1.3.2、1.3.3、1.3.4節的方法進行多糖在口腔、胃和腸道的模擬消化實驗。取上述模擬消化反應后的樣品溶液，4 800 r/min離心10 min后取上清液，用水定容到50 mL備用。然后進行模擬消化后消化產物分子質量、還原糖質量濃度和單糖組成的測定。

模擬消化物還原糖質量濃度的測定：具體方法參照《中華人民共和國藥典》（2015版）中槲葉多糖含量測定中還原糖的測定方法（3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法）。精密量取多糖在口腔、胃和腸模擬消化反應后的樣品溶液各2 mL，置于25 mL稱量瓶中，分別加入DNS 1.5 mL，搖勻，沸水浴中加熱5 min，迅速用涼水冷卻，加水至刻度，搖勻后在530 nm波長處分別測定吸光度。以2 mL水同法制成空白溶液按上述步驟進行同樣操作。

消化產物分子質量的測定：離心過的上清液經0.22 μm水相膜過濾，通過1525高效液相色譜儀（配2414示差折光檢測器和Empower3工作站）測定其分子質量的變化。色譜條件為：色譜柱為UltrahydrogelTMLinear（7.8 mm×300 mm，10 μm）；流動相為0.1 mol/L NaNO3；流速為0.9 mL/min；柱溫35 ℃。

模擬多糖消化物單糖的測定：將剩余上清液全部裝入5 00～1 000 Da透析袋后，將透析袋置于含有50 mL生理鹽水的燒杯中，使透析時間與模擬消化時間一致。取透析袋外的液體，經0.22 μm水相膜過濾，通過陰離子色譜ICS 5000檢測單糖組成。以生理鹽水作為空白對照。

離子色譜條件為：C a r b o P a c PA 2 0分析柱（150 mm×3 mm，6.5 μm）和CarboPac PA 20G保護柱（30 mm×3 mm，6.5 μm）；流速為0.5 mL/min；進樣量25 μL；檢測器工作電極為金電極；柱溫箱溫度為30 ℃；檢測器溫度為35 ℃[26]。其中，單糖混合標準溶液的配制過程如下：取巖藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖和核糖標準品，用去離子水配制成3.85 mg/L的混標溶液。

1.3.7 模擬消化后金釵石斛酚類物質的成分分析

模擬消化后金釵石斛酚類物質的成分分析參照文獻[27-28]?；旌蠘藴势返呐渲疲悍謩e精確稱取適量的蕓香葉苷、綠原酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、熊果酸、芹菜素、沒食子酸、槲皮素標準品，用體積分數50%甲醇溶解，配制成混合標準溶液，使得每種標準品的質量濃度均為1 mg/mL。4 ℃條件下保存備用。

色譜條件：色譜柱為HSST3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為水和0.1%甲酸。梯度洗脫（洗脫程序見表3）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃。

表3 梯度洗脫參數Table3 Parameters of gradient elution procedure

質譜條件：電噴霧電離離子源（electrospray ionization，ESI）負離子模式（ESI-）；離子源溫度130 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；錐孔氣流N2流速50 L/h；脫溶劑氣流速400 L/h；碰撞氣體流量0.12 mL/min；毛細管電泳電壓3 500 V；載氣為氦氣；多反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

1.4 數據分析

以上實驗均平行進行3 次，得到的數據經SPSS 20.0軟件處理，采用Dunnett’s檢驗進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 金釵石斛石斛堿在口腔、胃和腸道模擬消化過程中溶出率的變化

經人工模擬口腔、胃液和小腸消化后，各個實驗組（除P組外）中石斛堿溶出率如圖1所示。

圖1 金釵石斛石斛堿溶出率Fig.1 Dissolution rate of dendrobine from D. nobile

由圖1中可知，在模擬唾液消化液中，石斛堿溶出率的大小依次是D＜CP＜SP＜AE＜WE；在模擬胃消化液中，石斛堿溶出率的大小依次是D＜CP＜AE＜SP＜WE；在模擬腸道消化液中石斛堿溶出率大小依次是D＜A E＜W E＜C P＜S P；各組之間均有顯著性差異（P＜0.05）。由此可推測，粗石斛堿在模擬消化中溶出效果較差，與醇提物相比，水提物中的石斛堿更易溶出。最終，在模擬腸道消化液中金釵石斛全粉和提取物（水提物/醇提物）的石斛堿溶出率較粗石斛堿高，且超微粉中石斛堿溶出率（（21.46±0.52）%）顯著高于普通粉（（19.20±0.95）%）（P＜0.05）。由此可以得出，金釵石斛超微粉由于粉碎顆粒粒徑小，能減少有效成分的溶出阻力，提高有效組分的溶出率，同時表面積增加使金釵石斛粉顆粒分散均勻，能更好地溶解在胃腸液中，同時可以增大顆粒與胃腸黏膜的接觸面積，從而有利于藥物的吸收，增大藥物的生物利用率[29]。

2.2 金釵石斛多糖在口腔、胃和腸道模擬消化過程中溶出率的變化

經人工模擬口腔、胃液和小腸消化后，由于金釵石斛醇提物中多糖質量分數較低，為0.19%，故本實驗未考慮醇提物中多糖溶出率的變化。各個實驗組（除AE與D外）中多糖溶出率變化如圖2所示。

圖2 金釵石斛多糖溶出率Fig.2 Dissolution rate of polysaccharide from D. nobile

由圖2可知，金釵石斛超微粉在口腔和胃中的多糖溶出率分別為（4.29±0.22）%和（5.43±0.22）%，均高于金釵石斛普通粉（（1.9 9±0.0 8）%和（3.25±0.16）%），并且具有顯著性差異（P＜0.05）；說明超微粉中細胞破碎程度更大，粒徑較小，使多糖溶出速率加快[30]。而腸道中超微粉的多糖溶出率反而比普通粉較低，可能是因為與普通粉相比，超微粉在模擬消化過程中多糖溶出更早地達到平衡狀態且多糖鏈部分斷裂的緣故所致[17]。金釵石斛水提物在口腔、胃和腸道模擬消化過程中多糖溶出率無明顯差別，可以得出金釵石斛水提物易釋放出多糖組分，在口腔中多糖溶出已達到平衡狀態。

2.3 體外模擬口腔、胃和腸道對金釵石斛多糖的消化結果

2.3.1 模擬消化物多糖分子質量和還原糖質量濃度的變化

由表4可知，金釵石斛多糖經模擬唾液、模擬胃液消化的過程中分子質量逐漸減小，即從2 737 Da降低為1 425 Da和386 Da，還原糖質量濃度整體隨消化時間的延長而增加（P＜0.05），說明多糖分子支鏈產生變化，糖苷鍵斷裂而導致分子質量降低。消化前多糖溶液中還原糖質量濃度與多糖溶液經模擬唾液消化后產物中還原糖的質量濃度無顯著性差異。

表4 金釵石斛多糖在模擬口腔、胃和腸道消化后多糖分子質量和還原糖質量濃度的變化Table4 Changes in the molecular weight of polysaccharide and reducing sugar content in D. nobile in in vitro digestion model

2.3.2 模擬消化后單糖產生情況

表5 單糖混合標準溶液中單糖組成及質量濃度Table5 Monosaccharide composition and concentrations of mixed standard solution

圖3 金釵石斛多糖消化后的離子色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatogram of polysaccharide in in vitro digestion products of D. nobile

多糖經模擬消化后糖苷鍵發生斷裂，可能生成了寡糖或者單糖[31]，從而暴露出更多的還原末端，使得還原糖的含量增加。將消化液裝入只有小分子多糖、寡糖或者單糖可以自由進出的透析袋（3 500 Da）中進行檢測。由圖3可知，模擬口腔、胃、腸道消化液中均沒有檢測到表5中11種單糖，表明消化后沒有游離單糖的釋放。這與張冠亞等[17]對鐵皮石斛多糖體外模擬消化實驗的結果是一致的。由此可知，金釵石斛多糖的空間結構復雜，主鏈和支鏈都是由糖苷鍵連接而成，糖苷鍵的斷裂使多糖分子質量減小，所以其性質也可能隨之發生改變[32]。

2.4 模擬消化后多酚化學成分變化情況

通過UPLC-TQD-MS分析發現，各組金釵石斛消化液中含有蕓香葉苷、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸和槲皮素5 種化學物質。金釵石斛全粉（超微粉/普通粉）和提取物（水提物/醇提物）中這5 種多酚類物質的質量濃度如圖4所示。

圖4 金釵石斛超微粉、普通粉、水提物和醇提物模擬消化液中5 種多酚類物質的質量濃度Fig.4 Polyphenol concentrations in in vitro digestion products of D. nobile

由圖4a可知，消化前水提物中蕓香葉苷的質量濃度比醇提物中低，分別為0.026 5、0.036 2 μg/mL（P＜0.05）。蕓香葉苷在普通粉和水提物中釋放緩慢，在從模擬唾液到模擬胃液的消化過程中其質量濃度不斷增加，經模擬腸道消化后質量濃度降低，可能是受消化液pH值和離子、蛋白質等化學成分的影響[33]。超微粉和醇提物中蕓香葉苷釋放較快，且在模擬唾液、胃液和模擬腸液中質量濃度逐漸降低。由圖4b可知，綠原酸在醇提物中的質量濃度（0.009 6 μg/mL）高于水提物（0.005 0 μg/mL）（P＜0.05），且醇提物中綠原酸釋放不完全。由圖4c～e可知，醇提物中阿魏酸質量濃度（2×10-6μg/mL）較低，而在水提物中的質量濃度相對較高（0.051 μg/mL），但二者在模擬消化液中的質量濃度均很低。沒食子酸和槲皮素均表現為水提物中的質量濃度高于醇提物（P＜0.05）。隨著消化的進行，沒食子酸在模擬胃液中的質量濃度比消化前溶液中質量濃度高，可能是由原料和消化液中化學成分的轉化和蛋白質、碳水化合物或者糖殘基等大分子物質的裂解導致[34]。由圖4還可知，金釵石斛超微粉比普通粉更易促使其中的化學成分溶出，主要因為超微粉比普通粉粉碎強度大，細胞內多糖、蛋白質、纖維素等大分子物質更易釋出，且大分子物質之間彼此交聯形成空間網絡結構，使溶液穩定性好，利于人體消化吸收利用。

3 結 論

通過體外模擬人體消化系統（口腔、胃和小腸），分別模擬了唾液、胃液和腸液對金釵石斛超微粉、普通粉、水提物、醇提物、粗石斛堿和粗多糖的消化作用。通過模擬消化實驗得出金釵石斛堿和多糖在消化過程中溶出的規律，以及石斛堿、多糖和多酚類物質在模擬消化過程中的變化。金釵石斛全粉（超微粉/普通粉）和提取物（水提物/醇提物）石斛堿在模擬腸道消化液中溶出率大小依次為金釵石斛超微粉＞普通粉＞水提物＞醇提物＞粗石斛堿。且石斛堿溶出率在整個模擬消化過程中逐漸增大。金釵石斛多糖在水提物中更易溶出，且在唾液中基本達到溶出平衡的狀態，在胃和腸道中溶出率降低。金釵石斛多糖在模擬消化的過程中，在模擬胃部和腸道部分其分子質量降低，還原糖的含量也升高，但經透析后沒有檢測到單糖。故可以推測，金釵石斛多糖在模擬消化過程中，多糖的糖苷鍵部分斷裂，但是沒有釋放出游離的單糖。多酚類物質的質量濃度在模擬胃液消化物中最高，在模擬腸道消化物中降低。

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