蛋白溶出與變性結合消減蝦仁致敏性

王星璇，胡志和*，柳瀾昱，王麗娟，薛 璐，吳子健

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

南美白對蝦（Penaeus vannamei）不僅產量高，也是百姓餐桌上常見的美味佳肴[1-3]。然而，這樣的美味卻是潛在的食物過敏原，在過敏人群中，就有20%會對其過敏[4]，嚴重影響了過敏體質人群的生活質量。采用何種方法可以在保存蝦仁完整結構和風味的基礎上，消除其致敏性，讓過敏群體安全地享受蝦的美味，已經成為研究的熱點。

超高靜壓技術（high hydrostatic pressure processing，HPP）是一種冷殺菌技術，其作用是純物理過程，液體傳壓、各向壓力均等的特點能夠保留受壓物體的外觀形狀[5-6]；只作用于構成空間結構的氫鍵、離子鍵、疏水鍵等非共價鍵，不會影響共價鍵[7]；由于加工過程產生的熱量很小，可以保持食品原有的營養成分、色澤和天然風味[8-9]。自1899年美國化學家Hite[10]將超高壓技術用于牛乳的保藏研究以來，目前該技術已經用于乳品[11-13]、果汁[14-15]、果醬[16]、水產品[17-19]、肉類[20-22]、谷物[23-24]和蔬菜[25]等的加工。

由于超高靜壓能夠改變蛋白質分子的空間構象[26-27]和促進溶質擴散[28]，因此也用于消減過敏食物的致敏性。Kato等[29]將精白米置于蒸餾水中并在100～400 MPa的壓力下對其進行加壓處理，可使大量的過敏性蛋白質溶出。Pe?as等[30-31]在200 MPa 和300 MPa條件下處理大豆蛋白，可大幅度降低其致敏性。Husband等[32]研究了熱和高壓對蘋果的2 個主要過敏原（Mal d 1、Mal d 3）及Bet v 1（類似芹菜中過敏原Api g 1）的影響，發現通過加熱或提高壓力可以有效降低其主要過敏原。張悅等[33]將蝦仁在100 MPa、25 ℃條件下處理15 min，蝦仁的致敏性降低了67.09%，且與處理過程中蛋白溶出量有關。蔡秋鳳等[34]研究發現超高壓使蛋白質三級結構遭到破壞，與Ca2+結合能力變弱，導致小清蛋白的免疫活性降低，從而達到了對魚類過敏原消減的效果。

本研究利用超高靜壓能夠促進溶質擴散和引發蛋白質空間構象變化的性能，采用超高靜壓處理南美白對蝦的鮮蝦仁，在保留蝦仁結構完整的基礎上，消減其致敏性，為利用超高壓技術降低水產品致敏性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對蝦 天津市韓家墅水產市場。

兔抗南美白對蝦原肌球蛋白免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG抗體和羊抗人IgE抗體 美國Sigma公司；Page Ruler Prestained Protein Ladder標準蛋白 美國Thermo公司；酶標板美國Corning Costar公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；HPP.L2-1000/1型超高壓設備 華泰森淼生物工程技術有限公司；3-18K型離心機 美國Sigma公司；SpectraMax190型酶標分析儀 美國美谷分子儀器有限公司；UNIVERSAL HOOD Ⅱ凝膠電泳成像儀 美國Bio-Rad公司；24DN型電泳槽、DYY-8C型電泳儀北京市六一儀器廠；FD-2冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；UDK159全自動凱氏定氮儀 意大利VELP公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦仁的超高壓處理

將新鮮南美白對蝦清洗，去頭、尾、殼以及腸線，制成蝦仁。并按照1 個孔/cm2的密度對蝦仁進行扎孔，稱質量。將蝦仁與質量分數0.9% NaCl溶液按照質量比1∶4混合，然后用聚乙烯袋真空密封。采用超高壓設備處理真空密封的樣品。壓力傳遞介質為葵二酸二辛酯，處理溫度為室溫，壓力范圍為0.1～900.0 MPa，保壓時間為10～50 min。

1.3.2 高壓處理后蝦仁的溶出蛋白及殘留蛋白含量測定

將處理的蝦仁從溶液中取出，將溶液在4 000 r/min條件下離心15 min，取50 mL上清液檢測溶出蛋白質量濃度；取處理后濕基蝦仁1 g進行蝦仁溶出蛋白和殘留蛋白含量的測定。溶出蛋白質量濃度、溶出蛋白含量、殘留蛋白含量均采用GB 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[35]凱氏定氮法測定。

1.3.3 高壓處理后蝦仁的溶出蛋白及蝦仁殘留蛋白質的分子質量分布

不同壓力（0.1～900.0 MPa）處理30 min后，將蝦仁取出，溶液4 ℃、4 000 r/min離心15 min，上清液經透析（截留分子質量3 500 Da）、凍干后獲得溶出蛋白。

蝦仁殘留蛋白的制備參考李振興[36]的方法并進行修改。將高壓處理（0.1～900.0 MPa）后的蝦仁勻漿，每克組織用1 mL的生理鹽水懸浮，懸浮液置于冰上5 min后加入4 倍體積冷丙酮（-20 ℃預冷過夜），充分混勻，置于0 ℃條件下30 min，期間混勻數次，于4 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集沉淀物。將沉淀物再次用冷丙酮懸浮、混勻，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，將沉淀物移至干凈濾紙上自然風干，制得蝦蛋白丙酮粉。再將丙酮粉與含有0.5 mmol/L二硫蘇糖醇的1 mol/L KCl抽提液按1∶10（m/V）的比例混合進行抽提過夜，4 ℃、4 000 r/min離心30 min，取上清液，沉淀物用抽提液按1∶10（m/V）抽提4 h，離心取上清液，將兩次的上清液合并后透析（截留分子質量3 500 Da），截留物經冷凍干燥，獲得蝦仁粗提蛋白。

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析蛋白質種類。電泳條件：15%分離膠，5%濃縮膠，上樣溶液質量濃度5 mg/mL，上樣量10 μL。

利用凝膠電泳成像儀分析電泳膠片，用隨機Quantity One軟件分析蛋白質的分子質量分布。

1.3.4 過敏血清來源

血清樣品采集于12 個蝦過敏患者，分別來自山東省榮成市石島人民醫院、河北省唐山市開灤醫院和甘肅省天水市第一人民醫院及天津商業大學校醫院。性別分布為7 男，5 女；年齡分布20～23 歲7 人，35～40 歲4 人，52歲1 人。通過臨床診斷為蝦類過敏，采用皮膚點刺實驗，其檢測結果大于陽性對照范圍的1/2為“++”，將所有患者的血清混合；另外，采集20 名非過敏人的血清（天津商業大學校醫院），作為陰性對照。所有血清樣品置于-80 ℃冰箱凍存。

1.3.5 IELISA法檢測高壓處理后蝦仁蛋白及溶出蛋白的致敏性

從不同條件處理后的蝦仁中提取蛋白，分別用兔抗原肌球蛋白的IgG抗體、對蝦過敏的人血清為一抗，以未處理組蝦仁中提取的蛋白為對照，采用間接酶聯免疫吸附測定（indirect enzyme-linked immunosorbent assay，IELISA）法檢測蝦仁的致敏性[37]，通過抗體與抗原結合的光密度值變化，表示致敏性的變化。具體操作如下。

將高壓處理蝦仁的蛋白提取物或溶出蛋白用pH 9.6的Na2CO3/NaHCO3緩沖液配制成質量濃度為0.5 mg/mL的溶液，向酶標板中每孔加入100 μL，4 ℃下包被26 h。棄掉抗原稀釋液，用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）（1 000 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中含1 mL吐溫20）洗板，拍干后每孔加入封閉液（含質量分數1%的牛血清白蛋白的PBST）200 μL，37 ℃下保溫2.5 h。棄去封閉液，用PBST洗板，拍干。每孔加入100 μL抗體溶液（蝦過敏患者血清用封閉液1∶160（V/V）稀釋，兔抗南美白對蝦原肌球蛋白IgG抗體用封閉液1∶750（V/V）稀釋），37 ℃下孵育2 h，棄去孔中液體，用PBST洗板。每孔加100 μL二抗溶液（HRP標記的羊抗人IgE抗體用封閉液1∶800（V/V）稀釋，HRP標記的羊抗兔IgG抗體用封閉液1∶1 000（V/V）稀釋），37 ℃下孵育1 h。棄去孔中液體，用PBST洗板，拍干。每孔加入100 μL鄰苯二胺底物液（0.1 mol/L檸檬酸4.86 mL、0.2 mol/L Na2HPO45.14 mL、4 mg鄰苯二胺、3% H2O250 μL），37 ℃下閉光放置15 min，然后每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液。用酶標儀在492 nm波長處測定其光密度值（OD492nm）。所有實驗設3 個平行。

包被在酶標板中的抗原與抗體（蝦仁中提取的蛋白）結合后形成抗原-抗體復合物，與再加入酶標二抗反應，通過顯色液顯色，用酶標儀測定其光密度值。光密度值可以反映出抗原和抗體結合的程度。蝦仁蛋白致敏性的消減率按照下式計算。

1.3.6 高壓下蛋白溶出與變性結合消減蝦仁致敏性

將真空密封后的蝦仁，在200 MPa室溫保壓30 min的條件下進行處理。然后在600 MPa室溫保壓不同時間（10～30 min）條件下進行高壓處理，檢測每次處理后蝦仁致敏性變化。

1.4 數據處理

所有實驗數據采用SPSS 16.0統計軟件分析，顯著性分析采用單因素方差分析方法，實驗結果均以表示，圖表制作利用軟件Origin 8和Excel 2007。

2 結果與分析

2.1 高壓處理時間對蝦仁蛋白質溶出量的影響

將真空密封的蝦仁，在室溫和300.0 MPa壓力下分別處理10、20、30、40、50 min，通過凱氏定氮法檢測處理后溶出液中蛋白質含量，結果如圖1所示。

圖1 室溫、300.0 MPa條件下不同保壓時間對蝦仁蛋白質溶出量的影響Fig.1 Effect of treatment time at 300.0 MPa and at room temperature on protein solubilization

由圖1可知，不同保壓時間處理的蝦仁蛋白質溶出量均有顯著性差異（P＜0.05）。在室溫、300.0 MPa下，保壓時間在10～30 min內，隨著保壓時間的延長，蛋白質溶出量增多，當保壓時間為30 min時，蛋白質溶出量最高，為25.69 mg/g；在30～50 min范圍內，隨著保壓時間的延長，其蛋白質的溶出量逐漸降低。出現該現象的原因可能是隨著時間的延長，蝦仁蛋白質的變性導致溶解性的變化[38]。

2.2 壓力對蝦仁的蛋白質溶出量及剩余量的影響

在室溫下，用不同壓力（0.1～900.0 MPa）處理蝦仁30 min，蝦仁和溶出液中蛋白質含量的結果如圖2所示。

超高壓處理會使蝦仁中蛋白質溶出，各壓力下蛋白質溶出量均高于對照組（0.1 MPa）；當壓力小于200.0 MPa時，隨壓力提高，溶出蛋白量逐漸增高；當壓力大于200.0 MPa時，隨壓力增大，蛋白溶出量逐漸降低（圖2）。在實驗的壓力范圍內，200.0 MPa時蛋白溶出量最多，為37.9 mg/g。另外，蝦仁中殘留的蛋白質含量在200.0 MPa時最低，為146.1 mg/g；因此，200.0 MPa的處理條件有利于蛋白質的溶出。其原因可能是因為當壓力在200.0 MPa時，蛋白質極性基團的暴露增多，蛋白質的水化作用增強，溶解性得到極大提高，導致蝦仁蛋白質更多地溶出[39-40]。隨著壓力的繼續增大（300.0～900.0 MPa），蝦仁蛋白溶出量隨壓力增大而減小。過高的壓力導致蛋白質凝膠發生破裂，大分子蛋白聚合體解聚，疏水位點與新的二硫鍵暴露，產生不同組分的聚集變性[41-43]。

圖2 室溫下不同壓力處理30 min對蝦仁的蛋白質溶出量的影響Fig.2 Effect of pressure at room temperature for 30 min on protein solubilization

2.3 不同壓力下蝦仁溶出蛋白質的分子質量分布

不同壓力對蛋白質空間構象產生影響，從而導致蛋白質分子某些性質變化，其中包括其溶解性能。不同壓力處理蝦仁，溶出蛋白SDS-PAGE結果見圖3，電泳圖經凝膠電泳成像儀分析其分子質量分布，結果見表1。結果表明，對照組蝦仁共有26 種蛋白質溶出，與蝦仁粗提蛋白種類一致。經超高壓處理后，壓力為100.0 MPa時，沒有分子質量為106.7 kDa的蛋白質溶出；在200.0～300.0 MPa壓力處理條件下，蝦仁溶出蛋白種類一致，有2 種蛋白（106.7 kDa和191 kDa）沒有溶出；壓力不低于400.0 MPa時，分子質量超過106 kDa的5 種蛋白沒有溶出；當壓力為500.0 MPa時，有14 種蛋白沒有溶出；當壓力在600.0～900.0 MPa之間時，溶出蛋白種類相同，有17 種蛋白沒有溶出。造成這一現象的原因，可能是在高壓作用下蛋白質水合作用發生變化，導致其溶解性變化[38-44]。

圖3 不同壓力下溶出蛋白的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of protein solubilization after treatment at different pressures for 30 min at room temperature

表1 不同條件下處理的溶出蛋白分子質量分布Table1 Molecular weight distribution of proteins from shelled shrimp treated at different pressures

另外，蝦類主要的過敏原蛋白為分子質量36 kDa的原肌球蛋白[45]，在各種壓力下均有溶出。采用凝膠電泳成像儀對電泳圖譜（圖3B）的分析發現，在200.0 MPa下處理蝦仁，溶出蛋白中36 kDa蛋白占較高的比例（圖4）；這一結果為高壓溶出消減蝦仁致敏性提供了理論依據。

圖4 不同壓力下溶出蛋白液中分子質量為36 kDa的蛋白質質量濃度Fig.4 Concentration of 36 kDa proteins from shelled shrimp treated at different pressures

2.4 高壓處理后蝦仁提取蛋白及溶出蛋白的致敏性變化

2.4.1 高壓處理后蝦仁提取蛋白的致敏性變化

圖5 不同壓力作用下蝦仁致敏性消減結果Fig.5 Effect of HHP treatment at different pressures on allergenicity of shelled shrimp

由圖5可知，加壓可以降低蝦仁的致敏性，不同的高壓條件下蝦仁致敏性的消減率有顯著差異（P＜0.05）。壓力在100.0～600.0 MPa的范圍內，隨著壓力的增加，抗體與抗原結合的OD492nm隨之減小；當壓力在600.0～900.0 MPa范圍內，抗體與抗原結合的OD492nm隨壓力增大而提高，且采用兔抗TM的IgG為一抗抗體（圖5A）和用過敏者血清為一抗抗體（圖5B）檢測結果的趨勢一致。在600.0 MPa下致敏性消減效果最好，與未處理的蝦仁提取蛋白（OD492nm為0.34）相比，用過敏者血清為一抗檢測，致敏性消減了41.82%（圖5B）；用兔抗TM的IgG為一抗檢測，致敏性消減了44.15%（圖5A）。

此外，比較不同壓力下蝦仁致敏性（圖5）與蝦仁殘留蛋白含量或溶出蛋白含量（圖2A）之間關系可以發現，當壓力在0.1～300.0 MPa范圍內，其致敏性變化與蝦仁中殘留蛋白含量正相關，與溶出蛋白含量負相關；壓力在400.0～900.0 MPa之間，其致敏性變化與蝦仁蛋白的殘留量和溶出量無關。因此，可以推斷在0.1～300.0 MPa范圍內，蝦仁致敏性消減與蝦仁蛋白溶出有關；在400.0～900.0 MPa范圍內，致敏性變化與蝦仁蛋白變性有關。

2.4.2 高壓處理后蛋白溶出量及變性與致敏性關系

圖6 不同壓力處理的蛋白溶出液稀釋12.5 倍后致敏性變化Fig.6 Allergenicity of 12.5-fold diluted proteins from shelled shrimp treated at different pressures

比較圖6和圖2可知，壓力在0.1～300.0 MPa范圍內，其致敏性變化與蛋白溶出量正相關；在100.0、400.0 MPa和500.0 MPa下處理的蝦仁的溶出蛋白含量無顯著差異（圖2A），但溶出蛋白的致敏性存在顯著差異（圖6）；因此，當壓力大于400.0 MPa時，蝦仁蛋白的致敏性與溶出量無關，與其構象的變化（變性）有關[46]。

將溶出蛋白冷凍干燥，配制成0.5 mg/mL的溶液后進行包被，檢測其致敏性（用過敏者血清為一抗檢測），研究溶出蛋白致敏性與變性的關系，結果見圖7。壓力在0.1～600.0 MPa范圍內，隨著壓力的增大，其致敏性逐漸降低，在600.0 MPa時，致敏性最低，與未處理蝦仁蛋白相比，消減率為59.85%，且100.0 MPa和200.0 MPa時致敏性無顯著差異；當壓力在600.0～900.0 MPa范圍內，隨壓力的增加，其致敏性反而增大。

比較圖7與圖3可知，高壓處理會改變蛋白構象，從而導致其某些性質的變化，包括溶解性（圖3），進而導致致敏性變化（圖7）；但蛋白構象變化程度（變性程度）不同，導致其溶解性及致敏性變化程度不同，在較低的壓力下（≤300.0 MPa），蝦仁蛋白只有2 種蛋白不能溶出（圖3），致敏性消減率只有25.53%（300.0 MPa）；400.0 MPa壓力下，有5 種蛋白沒有溶出，且均為大分子蛋白（分子質量大于等于106 kDa）（圖3），致敏性消減率為29.41%；但當壓力大于500.0 MPa時，有14～17 種蛋白沒有溶出（圖3），且致敏性消減率為54.18%（500.0 MPa）。因此，引起蝦仁多種蛋白變性的壓力應不低于500.0 MPa，且在600.0 MPa下致敏性消減較好（致敏性消減率為68.79%）。

圖7 不同壓力處理后的蝦仁溶出蛋白的致敏性Fig.7 Allergenicity of proteins from shelled shrimp treated at different pressures

2.5 蛋白溶出與變性相結合消減蝦仁致敏性

綜合不同高壓條件下蝦仁蛋白溶出量（圖2）、變性與致敏性關系（圖7），采用200.0 MPa和600.0 MPa相結合的處理方式，消減蝦仁的致敏性。

2.5.1 在200.0 MPa下多次處理對蝦仁致敏性的消減

將蝦仁在200.0 MPa保壓處理30 min的條件下，進行多次處理，蛋白溶出質量濃度變化和蝦仁殘留蛋白致敏性變化見圖8。處理4、5、6 次的蛋白溶出量和蝦仁致敏性均無顯著性差異（P＞0.05），與處理3 次相比，存在顯著差異（P＜0.05）。因此，從蛋白溶出量分析，處理4 次即可。綜上，200.0 MPa、室溫、保壓處理30 min，經4 次處理，蝦仁的致敏性降低到較平穩水平（OD492nm為0.107），與未處理蝦仁蛋白（OD492nm為0.340）相比，致敏性消減率為68.53%。

圖8 在200.0 MPa下處理次數對溶出液蛋白質量濃度（A）和蝦仁殘留蛋白致敏性（B）的影響Fig.8 Effect of number of 200.0 MPa treatments on protein solubilization (A) and allergenicity of shelled shrimp (B)

2.5.2 蛋白溶出與變性結合處理對蝦仁致敏性消減效果

蝦仁在200.0 MPa室溫保壓30 min的條件下處理后，再經600.0 MPa、室溫保壓處理，每次處理后提取蝦仁蛋白，用過敏者血清為一抗，檢測致敏性變化，結果見表2。采用單一蛋白溶出（200.0 MPa）或蛋白變性（600.0 MPa）均不能較好地消減蝦仁的致敏性，而采用二者結合，先用200.0 MPa處理30 min，再用600.0 MPa處理20～30 min，就能夠較好地降低蝦仁的致敏性，蝦仁在200.0 MPa下處理30 min后，再用600.0 MPa處理30 min，蝦仁的致敏性消減率大于80%。

表2 經200.0 MPa處理后再經600.0 MPa處理對蝦仁致敏性的影響（n＝ 3）Table2 Effect of sequential treatment at 200.0 MPa followed by 600.0 MPa on allergenicty of shelled shrimp (n= 3)

根據實驗結果，即使采用兩種方法相結合的方式，也不能徹底消除蝦仁蛋白的致敏性。其原因在于，采用蛋白溶出的方式，由于溶解平衡，不能夠徹底溶出所有過敏原蛋白；采用蛋白變性的方式，只是通過改變蛋白空間構象從而改變其致敏性[47]。另外，高壓處理是物理過程，只能改變過敏原蛋白的構象表位，不會破壞其一級結構，即不會影響線性表位；因此，采用高壓處理，不能完全消除蝦仁蛋白的致敏性。

3 結 論

采用超高壓處理技術，能夠有效地消減蝦仁蛋白的致敏性。在處理過程中，不同壓力對蝦仁蛋白致敏性消減的作用方式不同，當壓力在100.0～300.0 MPa的范圍內，可促進蝦仁中致敏性蛋白的溶出，從而使得蝦仁的致敏性降低；壓力400.0～900.0 MPa范圍，可促進蝦仁致敏性蛋白結構的改變，從而使蝦仁的致敏性發生變化。采用適合蝦仁致敏性蛋白溶出和構象改變的壓力相結合的方式處理蝦仁，能夠更好地消減蝦仁致敏性。

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