乳源酪蛋白糖巨肽對結腸癌HT-29細胞抗炎及血管生成因子表達水平的影響

王秋萍，賈 彥，曹江鳴，趙 培，崔文靜，馬新穎，趙林森，閆亞麗,*，陳慶森,*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899）

乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）除了具有良好的營養特性之外，還有提高智力發育、促益生菌增殖以及免疫調節等活性[1-8]。結直腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，其發生發展和轉移是一個由遺傳和環境等諸多因素經過多步驟及內外因交互作用的結果，目前大多數學者認為結直腸癌的主要發病機制分為原癌基因和抑癌基因的突變、基因組的不穩定性[9]；其中基因組不穩定性包括染色體不穩定、微衛星不穩定和核苷酸對（CpG island，GPG）、甲基化表型[10]、鋸齒狀途徑[11]。部分研究學者還認為炎癥、腫瘤與結直腸癌密切相關，尤其是炎癥性腸病最可能發展成結直腸癌，有報道指出約20%的潰瘍性結腸炎患者在發病后的30 年左右可發展成結直腸癌[12]。核轉錄因子（nuclear transcription factor，NF）-κB廣泛存在于哺乳動物細胞中，在60%～80%的結腸癌細胞中都有所表達，約40%的結腸癌細胞中表現有NF-κB的活性，處于活性狀態的NF-κB開啟了調控一系列炎癥靶基因的工作，使其在細胞周期、凋亡和代謝病理過程中發揮重要作用[5-6,10]。近年來，本實驗室系統地從乳源CGMP對腸道免疫調控系統、腸道菌群變化的影響以及和腸道炎癥反應的相關性等方面進行了研究。證實乳源CGMP具有抗炎活性，在一定程度上可以改善、緩解和治愈炎癥性腸病。朱晨晨等[13]用惡唑酮誘導建立潰瘍性結腸炎小鼠模型，研究乳源CGMP對其結腸黏膜固有層CD4、CD8、SIgA及免疫信號通路MEKK1、Smad7表達的影響，發現乳源CGMP也可顯著降低結腸黏膜固有層中CD4、CD8的表達，促進SIgA的表達。同時抑制MEKK1和Smad7蛋白的表達，說明乳源CGMP具有維持腸黏膜免疫調節的平衡和保護腸黏膜免疫屏障功能。李偉等[14]研究了乳源CGMP對小鼠脾臟淋巴細胞亞群、腸系膜淋巴結中淋巴細胞亞群和派爾集合淋巴結（peyer patch，PP）淋巴細胞亞群的影響，通過實驗結果分析，長期灌胃乳源CGMP能夠介導腸黏膜免疫，促進脾臟和PP結T淋巴細胞亞群顯著增多，說明乳源CGMP能夠引起這些外周免疫器官產生相應的免疫應答。脾淋巴細胞的增殖是感染反應的一個環節，抑制脾淋巴細胞增殖表現為抑制免疫應答，Otani等[15]發現在小鼠的食物中加入乳源CGMP，可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠脾臟細胞的增殖，進而表明乳源CGMP具有調節免疫系統的作用。Monnai等[16]發現乳源CGMP干預后的細胞，家族細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-lra通過與IL-1的受體結合從而阻止了IL-1的作用，因此不能啟動脾臟細胞的擴增。Requena等[17]研究指出NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號可由牛乳糖巨肽（bovine glycomacropeptide，BGMP）激活，從而使人體巨噬細胞（human acute monocytic leukemia cell line，THP）-1的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-8和IL-1b的含量增加。Requena等[18]研究還發現，BGMP可激活NF-κB和MAPK信號通路，上調人單核細胞TNF、IL-1β和IL-8的分泌，并認為BGMP在腸道中可能起到抗炎的作用。Requena等[19]研究也證BGMP可以降低腸道炎癥的發生，BGMP可以抑制由刀豆蛋白誘導的脾細胞TNF-α和干擾素（interferon，IFN）-γ的表達。Rhoades等[20]證實了乳源CGMP可以抑制3 株腸致病性大腸桿菌對結直腸癌HT-29細胞株的黏附能力，從而緩解結直腸癌的發展。這些都充分說明乳源CGMP在結腸炎方面具有一定的抗炎作用。Yun等[21]通過研究乳源CGMP對LPS刺激的脾臟細胞產生免疫球蛋白的影響，發現免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A的濃度升高。乳源CGMP能夠促進正常B淋巴細胞的增殖，所以能夠增強機體的體液免疫系統。李榮華等[22]利用乳源CGMP刺激體外培養的小鼠骨髓源樹突細胞（dendritic cell，DCs），發現乳源CGMP可刺激DCs的成熟，并強烈地刺激生物相容復合體抗原（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ，在DCs對外源抗原的提呈過程中，MHC-Ⅱ發揮了至關重要的作用，說明乳源CGMP通過調節DCs中MHC-Ⅱ來發揮免疫調節作用。

基于以上的研究成果，本研究主要從炎癥因子和信號通路兩方面入手，以結腸癌HT-29細胞為研究對象，探究乳源CGMP的抗炎性能和免疫調節作用。通過免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細胞激活NF-κB信號通路，確定乳源CGMP通過抑制炎癥因子和血管生成因子的表達，從而達到減緩炎癥的程度，更為乳源CGMP作為功能性物質應用于結腸的健康提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CGMP 新西蘭Tatua公司；人類結腸癌HT-29細胞江蘇齊氏生物科技有限公司。

LPS 美國Sigma公司；胎牛血清 美國Gibco公司；NF-κB激活-核轉運檢測試劑盒、Nc-細胞核/漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質量濃度測定試劑盒 北京康為世紀科技有限公司；兔抗人p65多克隆抗體 英國Abcam公司；免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy3 上海碧云天生物技術有限公司；4',6-聯脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 北京索萊寶有限公司；人8 種炎癥因子酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、人8 種血管生成因子ELISA試劑盒 美國Signosis公司。

1.2 儀器與設備

HERAcell 240iCO2培養箱 美國Thermo公司；SpectraMax M5多功能讀板機 美國Molecular Devices公司；TE2000倒置拍照顯微鏡 日本Nikon公司；X-OMAT醫用X射線膠片 銳珂（廈門）醫療器材有限公司；3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳槽、DYCZ-40D迷你轉印電泳槽、DYY-2C電泳儀 北京六一儀器廠；QB-9001多孔振蕩器海門市其林貝爾儀器；Gel doc XR凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞的復蘇、培養、傳代及乳源CGMP溶液制備

結直腸癌HT-29細胞復蘇、培養、傳代及乳源CGMP溶液制備等方法參見文獻[7]。

1.3.2 免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細胞激活NF-κB信號通路

1.3.2.1 LPS細胞實驗分組

LPS溶液的配制：準確稱取50 mg LPS于5 mL的DMEM高糖培養基中，針頭過濾器過濾，-20 ℃凍存，使用時用DMEM培養基梯度稀釋至相應質量濃度。

HT-29細胞正常培養，傳代進行2～3 次，然后進行分組：正常對照組、LPS組1（0.01 μg/mL）、LPS組2（0.1 μg/mL）、LPS組3（1 μg/mL）、LPS組4（10 μg/mL），每組3 個復孔。

1.3.2.2 細胞爬片的制備

在48 孔板內滴入2 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），然后用鑷子放入玻片以確保其固定在孔板內。取對數生長期的細胞，棄去培養基，PBS洗滌3 次，胰酶消化后用于計數；用完全培養基調整細胞濃度為5×105個/mL，均勻接種細胞爬片，每孔100 μL，置于培養箱內培養24 h。取出孔板棄去培養基，PBS洗滌1 次，正常對照組加100 μL完全培養基，LPS組加入不同質量濃度的LPS溶液100 μL，在培養箱內孵育30 min。用彎針頭挑出細胞爬片置于培養皿蓋上，PBS洗滌1 次。

1.3.2.3 免疫熒光圖的觀測

1）固定：每個細胞爬片加入100 μL 4%多聚甲醛固定液固定10 min。2）洗滌：吸除固定液，用洗滌液洗滌3 次，每次4 min，注意每次在洗滌過程中盡量吸盡殘余液體，同時要保證表面的濕潤度，最后一次完全去除洗滌液。3）封閉：加入100 μL的免疫染色封閉液，室溫封閉1 h。4）一抗反應：吸除免疫染色封閉液，加入封閉液稀釋的NF-κB p65抗體（封閉液與抗體體積比為80∶1），在4 ℃條件下孵育過夜。5）洗滌：重復步驟2）。6）二抗反應：加入免疫染色封閉液稀釋抗兔Cy3抗體（封閉液與抗體體積比為100∶1）100 μL，避光室溫孵育1 h。隨后的步驟都要避光進行操作。7）洗滌：重復步驟2）。8）細胞核染色：加入細胞核染色液DAPI，室溫染色5 min。9）洗滌：重復步驟2）。10）熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.3 乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達的影響

HT-29細胞正常培養，傳代進行2～3 次，然后進行分組：正常對照組、LPS組、實驗組（CGMP組1：10-6mg/mL、CGMP組2：10-5mg/mL、CGMP組3：10-4mg/mL、CGMP組4：10-3mg/mL、CGMP組5：10-2mg/mL）。37 ℃、5% CO2培養箱內孵育24 h，PBS洗5 min，洗2 次，正常組加入完全培養基，LPS組和實驗組均加入LPS（1 μg/mL），均在培養箱內孵育30 min，然后LPS組和實驗組吸去LPS，之后LPS組加入完全培養基，實驗組加入不同質量濃度的乳源CGMP溶液，在培養箱內培養24 h，收集細胞培養液，1 200 r/min離心2 次，每次5 min。將得到的上清液直接進行8 種炎癥因子的檢測，對于血管生成因子檢測前用截留分子質量為3 ku的蛋白超濾管進行濃縮，10 000 r/min條件下離心5 次，每次10 min，將細胞上清液濃縮至1 mL后進行測定。其余操作按照試劑盒說明書，在多功能讀板機測量每個孔在450 nm波長處的吸光度（A450nm）。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件中的Duncan模型進行方差分析與多重比較，處理結果以表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細胞激活NF-κB信號通路

圖1 不同LPS質量濃度刺激下HT-29細胞免疫熒光圖Fig.1 immunof l uorescence images of HT-29 cells under LPS stimulation at different concentrations

NF-κB開啟轉錄功能的前提是NF-κB（p65）從細胞質轉移到細胞核中，而目前研究NF-κB的活化方法主要有凝膠電泳遷移實驗、熒光素酶報告基因測定NF-κB DNA結合活性以及免疫熒光技術等技術。其中免疫熒光技術可更為簡單直觀地觀察到p65的核移位情況。本研究采用DAPI和Cy3雙色熒光進行標記。DAPI是一種可以透過完整細胞膜與DNA強力結合的藍色熒光染料，即可對細胞核內的DNA染色而顯示出細胞核；因此，在熒光顯微鏡下藍色熒光圖像指示的為細胞核區；Cy3（箐類染料）是標記NF-κB（p65）抗體的紅色熒光染色劑。

細胞靜息狀態下，細胞內的NF-κB很少被激活而存在細胞質中，這時的紅色主要為細胞質的NF-κB。而激活后的NF-κB會轉移到細胞核，這時細胞核區也會出現紅色的熒光，核區紅色熒光越多，說明轉位的NF-κB（p65）越多，以此來代表NF-κB活化的程度。圖1顯示不同質量濃度LPS刺激下的免疫熒光圖，不同的濾光鏡分別采取同一視野。由免疫熒光檢測發現，在正常對照組圖1A1中，可清晰地看到呈現紅色熒光的細胞質（圖中未顯示，下同），中間內依稀可見空心的部分為細胞核，在圖1A3中通過與細胞核的藍色熒光染色疊加后，發現細胞核的顏色與疊加前幾乎無差別，說明NF-κB（p65）沒有發生核移位。而通過觀察經LPS刺激后的各組疊加后的圖片，發現出現了p65從細胞質內不同程度地轉移到細胞核內的現象。LPS組1疊加圖的胞核區染色不再是單一的藍色，伴隨輕微的紫色，原因是NF-κB的核移位使得細胞核內也表現出紅色熒光，當紅、藍顏色疊加后，便出現了藍紫色。NF-κB活化的程度越大，即核移位越多，胞核區的染色就越向紫色偏移，比較LPS組1～組4，發現LPS組3的胞核區疊加后的紫色更明顯，表明胞核內的紅色熒光更多；所以，LPS組3（1 μg/mL）是刺激HT-29細胞活化NF-κB信號通路的最適劑量。在此基礎上繼續考察了乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達的影響。

2.2 乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達的影響

2.2.1 乳源CGMP干預激活后的HT-29細胞的8 種炎癥因子表達水平

圖2 各細胞炎癥因子相對表達量的比較Fig.2 Comparison of relative expression levels of inf l ammatory factors

免疫因素是結腸癌發病機制的重要因素之一，大量的T淋巴細胞分泌各種促炎（TNF-α、IFN、IL-1、IL-6、IL-8）和抑炎（IL-4、IL-10）的炎癥因子，還包括趨化因子和集落刺激因子等，這些因子的反饋性又加重炎癥的損傷。采用ELISA試劑盒的方法測定細胞中炎癥因子相對表達量的結果如圖2所示，其中表達量相對較多的是GMCSF、GCSF、INF-γ、TNF-α、IL-8 5 種因子，剩余3 種因子的表達量一般。LPS組各種因子都明顯高于對照組和乳源CGMP組。同時綜合8 種因子經乳源CGMP的調節后，發現CGMP組2、CGMP組3和CGMP組4的對炎癥因子表達有明顯的影響。

2.2.2 乳源CGMP干預激活后的HT-29細胞的8 種血管生成因子表達水平

腫瘤持續性生長必須要依賴于血管，血管是腫瘤營養的運輸系統，亦是腫瘤轉移的重要途徑。采用ELISA的方法測定的細胞中血管生成因子相對表達結果如圖3所示，發現血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）β表達量最突出，乳源CGMP組不僅極顯著地下調了LPS刺激后的VEGF分泌，其表達量也低于正常對照組，具有極顯著性差異。其余的因子也呈現出LPS組的表達量最大，乳源CGMP均不同程度地抑制了各種因子的表達，總體趨勢均是先降低后升高。

圖3 各細胞血管生成因子相對表達量的比較Fig.3 Comparison of relative expression levels of angiogenic factors

3 討 論

NF-κB是一種高度保守的核轉錄因子，因其在細胞內參與了炎癥因子的調控和表達，所以亦稱之為炎癥反應鏈上的“基因開關”。在受到外界的刺激時，NF-κB可迅速產生反應而影響機體。研究指出，NF-κB與結直腸癌的關系密切[23]，因此研究NF-κB信號通路在結腸癌的發展中具有重大意義。

本研究以體外人源結腸癌HT-29細胞為模型，通過觀測p65核移位的現象確定NF-κB信號通路激活狀態，研究用LPS刺激細胞以確保NF-κB（p65）從細胞質轉移到細胞核內。由圖1發現，細胞內紅色熒光的強弱依賴于LPS的質量濃度，LPS的質量濃度越高，疊加后的紫色熒光越明顯，充分說明NF-κB信號通路的激活越徹底。Hwang等[24]用LPS（20 μg/mL）刺激人臍靜脈內皮血管細胞，同樣采用熒光技術，發現LPS可以激活NF-κB。Perkins等[25]以0.01、0.10、1.00 μg/mL的LPS刺激結腸癌SW620細胞1、3、6、12 h后測定Toll樣受體、NF-κB，結果顯示NF-κB的活化與LPS的質量濃度和時間均呈現依賴性，表明1 μg/mL是最適的劑量，與本實驗結果相同。本研究為乳源CGMP干預后的HT-29細胞在體外細胞模型中處于激活狀態提供了保障。事實表明，炎癥反應過程中細胞因子及相關蛋白質的表達往往與特定免疫信號通路的激活有著必然的聯系。腸黏膜受到外界刺激后造成NF-κB激活，過量表達部分炎癥細胞因子，如前列腺素E2、IL炎癥因子不斷刺激腫瘤細胞加劇了其發展轉移；進一步認識炎癥因子對結直腸癌及其他免疫相關性疾病的影響機制有助于降低炎癥性腸病誘發腸道腫瘤的概率[12]。近年來，轉錄因子NF-κB已被研究得較為透徹，絕大多數人認為其在細胞核內出現才代表NF-κB已具備轉錄活性，也有部分人認為只有核內磷酸化才能證明NF-κB被激活，對于p65的解釋更是充滿爭議。p65的磷酸化可以通過經典通路中的細胞內免疫反應中NF-κB激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）的作用也可直接與酪氨酸激酶結合，然后將其磷酸化。在國內的研究中發現p65蛋白的磷酸化位點具有多個，不同的位點磷酸化可產生不同的效果，其中研究較多的是第536位和第276位的絲氨酸（Ser）。Ser536的磷酸化都被解釋為有助于核因子的轉錄，在大鼠肉瘤（ratsarcoma，ras）、蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、核糖體S6蛋白激酶（ribosomal S6 kinase，RSK)通路增強核蛋白體S6能夠直接把核內的p65的Ser536磷酸化，通過降低與抑制蛋白IκB的結合從而增強NF-κB的活性[25-26]。磷酸化p65不僅僅只存在于細胞核內，在細胞質內也同樣存在，并且影響著p65在細胞質和細胞核內的定位。有研究發現276位的Ser磷酸化的p65能夠減少p65在細胞核內的積累，基因敲除磷酸化p65的Ser276的蛋白激酶（protein kinases，PKA）會使p65在核內的積累增多[27]，但也有學者認為Ser276被PKA磷酸化后增強了NF-κB與DNA的親和性。結合四唑鹽比色法[7]和免疫熒光測定的結果，并測定了不同質量濃度的CGMP對LPS刺激后的細胞核內p65蛋白的表達，結果表明實驗組均下調被LPS刺激的HT-29細胞內p65的表達，質量濃度10-5mg/mL和10-4mg/mL的乳源CGMP對p65的作用極其顯著；而低質量濃度10-5、10-4mg/mL和10-3mg/mL的乳源CGMP對p65的影響極顯著；其他質量濃度CGMP雖也在不同程度上降低了部分蛋白的表達，但與正常對照組相比，都沒有顯著性[7]。Ming Zhu等[8]研究了乳源CGMP對潰瘍性小鼠的影響，測定結腸組織的核蛋白內的p65，揭示了乳源CGMP可以降低模型組的蛋白的表達，本實驗的結果與其結論一致。

目前國內外研究CGMP對結腸癌的抗炎方面還比較少，而大多數的研究集中在生物活性肽方面，H?versen等[28]的實驗結果表明乳鐵蛋白可以抑制NF-κB的活性和細胞因子的表達量。J?rgensen等[29]以小鼠的腸道細胞為模型，用LPS刺激細胞發現，0.1 μg/mL LPS可最大程度活化NF-κB，牛初乳蛋白處理可顯著降低p65的轉錄。同時，Majumder[30]和Huang Wuyang[31]等從雞蛋清中提取的三肽可以抑制由細胞因子誘導的關鍵NF-κB信號通路，從而下調了在血管內皮中表達的炎癥蛋白。本研究的結果也與以上眾多研究結論相符，進一步說明了乳源CGMP可在炎癥相關的信號通路中發揮一定的作用，其作用機制為乳源CGMP進入細胞內直接作用到經典信號通路中的結點蛋白IKK上，在細胞質內就阻斷了p65的核移位和Ser536的磷酸化，使得細胞核的p65在不同程度上降低[6,8]。

無論是炎癥的產生還是血管的生成終歸咎于促炎因子與抑炎因子、血管生成因子與抑制血管生成因子之間的平衡被打破，導致免疫系統紊亂[3]。研究顯示有近25%的腫瘤是由慢性炎癥引發的，如部分結腸癌的形成就是由炎癥反復刺激結腸黏膜導致潰瘍性結腸炎演變的。腸上皮屏障的損傷增加了上皮的通透性，細菌等進入黏膜下層，刺激巨噬細胞、DCs產生促炎因子（TNF-α、IL-8、IL-1β）。這樣的炎癥微環境使腫瘤細胞分泌更多趨化因子和炎癥因子，招募免疫細胞并激活下游的信號通路。TNF-α可促使NF-κB途徑被激活，趨化巨噬細胞積累并轉錄大量的促炎因子而誘發結腸癌；中和TNF-α可以降低結腸癌的發生率[32]。腫瘤血管的生成是機體原有血管直接的實體瘤生長再血管化，血管形成的關鍵步驟是血管生成因子誘發細胞的增殖和游走。1971年Folkman等[33]從Walker256瘤細胞中提取了一種誘發血管生成物質，并正式命其為腫瘤血管生成因子。至今，已發現10多種血管生成因子，代表有TGF、VEGF、EGF、TNF-α及纖維蛋白等，這些血管生成因子不斷促進血管的生成。炎癥因子與血管生成因子存在一定的關聯，TNF-α不僅具有促炎因子的作用而且還發揮誘發血管生成因子的作用。更有研究證明粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子CMSCF在腸炎惡性轉化過程中高度表達，在LPS刺激結腸上皮細胞后可分泌CMCSF，更重要的是CMCSF又可促進腸道腫瘤上皮細胞直接釋放VEGF[34]。本結果顯示LPS刺激HT-29細胞后，促炎因子中CMCSF的表達量最高，對應的血管生成因子中VEGF也最為明顯，與前人的結果一致。結腸癌中的這些因子的轉錄由活化的NF-κB控制[35]。對于CMCSF促進VEGF的表達可能與ERK通路存在關聯，已有研究證明ERK通路也可調控VEGF的表達，CMCSF通過促進缺氧誘導因子1α的入核而誘導VEGF的表達[36]。

4 結 論

乳源CGMP具有調節激活后的NF-κB信號通路的能力，能有效抑制和改善結腸癌細胞的炎癥狀態，其機制為乳源CGMP可通過顯著下調結腸癌細胞中NF-κB信號通路的炎癥因子和血管生成因子的表達，從而達到減緩炎癥的程度。

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