清肺抑火中藥干預大氣PM_2.5對大鼠肺部炎癥損傷的實驗研究

楊瑩瑩　劉潔　蔣蓉芳等

摘要：目的 探討中藥清肺抑火中藥對PM2，致大鼠肺部炎癥損傷的干預作用。方法 將42只健康成年Wistar雄性大鼠隨機分為7組，分別為空白對照組、生理鹽水對照組、干預對照組、染毒對照組、低劑量干預組、中劑量干預組和高劑量干預組。處理結束后，收集各組大鼠肺泡灌洗液（BALF），并測定BALF中生化指標和炎癥因子水平的變化。結果 與生理鹽水對照組比較，染毒對照組BALF中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）的活力和總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、超敏C反應蛋白（HS-CRP）含量均升高，差異有統計學意義（P<0.05）。低、中、高劑量干預組BALF中生化指標和炎癥因子水平比染毒對照組水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 清肺抑火中藥可能通過抗細胞毒性和抗炎癥作用，減輕PM_2.5暴露對大鼠肺部產生的損傷。

關鍵詞：PM_2.5；中藥；干預 中圖分類號：R114 文獻標志碼：A

世界衛生組織（WHO）報道大氣顆粒物污染造成全球1%的心肺系統疾病和3%的氣管、支氣管疾病及肺癌，每年導致約60萬居民早死和740萬失能調整生命年（disabilily adjusted of lire years，DALY）的損失。由于PM_2.5粒徑小，表面積大，吸附有更多微小的有害物質，可通過呼吸到達肺泡并沉積在肺泡，甚至可以通過氣血屏障隨血液到達其他器官，對機體造成嚴重的損傷。研究表明，PM_2.5暴露與呼吸系統疾病的發生有明顯的相關性，如肺功能降低、哮喘發作、支氣管炎癥以及肺癌等。目前認為炎癥損傷和氧化應激損傷是PM_2.5對呼吸系統致病的主要機制，主要表現為PM_2.5進入機體后，通過多種途徑刺激炎性細胞釋放大量炎癥因子，誘發劇烈的炎癥反應，過多的炎癥因子本身所具有的機體破壞性對肺部正常組織或細胞造成損傷，引起肺部組織增生和纖維化，最終導致機體、肺部疾病的發生。為減小PM_2.5暴露對機體的損傷，研究者一直試圖尋找安全、有效拮抗PM_2.5對機體損傷的物質，如口罩、空氣凈化器、保健品（維生素C、維生素E、深海魚油等）。已有不少天然物質引入干預PM_2.5對機體損傷的研究，如具有抗炎、抗氧化作用的黑巧克力、番茄紅素、人參皂苷Rgl等。清肺抑火方劑來源于中醫古方《壽世保元》，是一種由抗炎和抗氧化的天然藥物制成的復方中藥制劑，包含黃芩、梔子、天花粉、知母、大黃、黃柏、前胡、苦參和桔梗九味中藥，具有清肺止咳、降火生津的功效。本研究以氣管滴注PM_2.5混懸液染毒大鼠造成的肺部炎癥損傷為模型，在PM_2.5染毒后給予清肺抑火中藥干預，觀察大鼠肺泡灌洗液中生化指標和炎癥指標的水平變化，探討清肺抑火中藥對PM_2.5染毒所致大鼠肺部炎癥損傷的干預作用。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Thermo Anderson G-2.5大流量采樣器為美國Thermo Fisher公司產品，紫外可見分光光度計為上海習仁科學儀器有限公司產品，MK3酶聯免疫檢測儀為廣州DENLEY公司產品，LGJ-10D冷凍真空干燥機為北京四環科學儀器有限公司產品，JL-180H超聲波清洗機購自南京科捷分析儀器有限公司，玻璃纖維濾膜購自河北省故城縣環境檢測器材廠。酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）標準比色試劑盒購自南京建成生物工程研究所。超敏C反應蛋白（HS-CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒購自美國EBIOSCIENCE公司。中性福爾馬林固定液、二甲苯、石蠟、蘇木精染液、1%伊紅酒精溶液、1%鹽酸酒精溶液、95%乙醇、無水乙醇、中性樹膠購自國藥集團。

1.2PM_2.5采集與處理

于上海市某居住區[附近無工業企業，周圍人口較密集，采樣期間監測PM_2.5濃度值為（39.95±22.33）μg/m³]，用大流量采樣器（采樣高度為16 m）采集大氣PM_2.5于玻璃纖維濾膜（孔徑2.5μm）上。將載有PM_2.5的玻璃纖維濾膜去掉邊緣部分，裁剪為1 cm×3 cm大小，放入錐形瓶，浸入超純水中，低溫超聲震蕩30 min×3次，將PM_2.5洗脫。6層紗布置于漏斗上，用于過濾PM_2.5震蕩液，濾液真空冷凍干燥，收集PM_2.5顆粒放于4℃冰箱中保存備用。臨用前，取一定量的PM_2.5顆粒物和0.9%生理鹽水制成濃度為8.89 mg/mL的PM_2.5混懸液（本研究中PM_2.5染毒劑量為40 mg/kg體重，每次給予PM_2.5生理鹽水混懸液的體積為4.5mL/kg，則所需配制的PM_2.5混懸液濃度為40mg/kg÷4.5 mL/kg=8.89 mg/mL，以體重計），超聲震蕩10 min混勻滅菌，4℃保存。

1.3實驗動物分組及處理

SPF級Wistar雄性大鼠42只，體重180～200 g，購于上海西普爾一畢凱實驗動物有限公司，合格證號：2008001641248。復旦大學倫理委員批準本實驗，批準號：20150652C002。動物購入后，在動物飼養室分籠飼養，每籠3～4只，飼養室溫度18～22℃，相對濕度45%～55%，12 h晝夜交替。適應性飼養2 d后，隨機分為7組，每組6只。清肺抑火膠囊去外殼，將內容物黃芩等九味中藥制成的粉末用濃度為0.2%的羧甲基纖維素溶液制成低、中、高濃度的混懸液。各組動物處理如下：空白對照組每天灌胃給予相應劑量以體重計（下同）為10 ml/kg 0.2%羧甲基纖維素溶液，持續1周；生理鹽水對照組氣管滴注1.5 mL/kg的生理鹽水，隔天1次，共1周；干預對照組每天灌胃給與0.66 g/kg的清肺抑火中藥混懸液1次，給藥1周；染毒對照組氣管滴注40 mg/kg的PM_2.5生理鹽水混懸液染毒，隔天1次，共3次；低、中、高劑量干預組在實驗第1周氣管滴注40 mg/kg的PM_2.5生理鹽水混懸液染毒，隔天1次，共3次，實驗第2周開始每天灌胃依次給予0.07/kg、0.33/kg和0.66g/kg清肺抑火中藥混懸液1次，共7次。

1.4大鼠一般體征觀察

研究開始時、第1周結束時和第2周結束時均測量并記錄每只大鼠體重，并在研究期間觀察各大鼠總體活動情況及呼吸狀況等指標。

1.5肺泡灌洗液提取與分析

于所有處理結束后24 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，劑量為3 mL/kg。稱重后，腹主動脈取血。用手術剪刀打開胸腔，止血鉗夾住一側肺葉，另一側用37℃預溫的生理鹽水灌洗3～4次，收集支氣管肺泡灌洗液（broehoalveolar lavage fluid，BALF）。將提取的BALF經4℃、3000 r/min（1006×g）冷凍離心20 min。離心后的沉淀細胞懸液制作涂片，用瑞士一吉姆薩復合染色，光學顯微鏡下進行細胞分類計數。取離心上清液，分裝放在凍存管中，于-80%冰箱保存。采用相應的試劑盒測定大鼠BALF中的酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）的活力和總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）；用ELISA試劑盒檢測細胞因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和超敏C反應蛋白（HS-CRP）水平，測定過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6統計學方法

采用Excel 2003建立數據庫，SPSS 22.0軟件進行統計分析，所有數據均以x±s表示。兩獨立樣本均數比較用studentstest進行檢驗；多組獨立樣本均數比較用單因素方差分析（One-Way ANO-VA），應用最小顯著差法（Least significant differ-ence，LSD）進行組間兩兩比較，應用Levene法檢驗獨立樣本間的方差齊性，檢驗水準為0.05。

2結果

2.1大鼠一般體征變化

實驗期間未見大鼠死亡。空白對照組、生理鹽水對照組和干預對照組大鼠活動未見異常。染毒對照組大鼠PM_2.5染毒后出現呼吸急促、腹式呼吸幅度增加的癥狀，細聽可聞及哮鳴音，總體活動量減少。低、中、高劑量干預組大鼠用清肺抑火中藥干預后，呼吸急促有緩解，哮鳴音和腹式呼吸減少。干預對照組、生理鹽水對照組與空白對照組大鼠的體重正常增長，且實驗開始第1周（動物飼養第3天）、第2周（動物飼養第17天）結束時，3組體重差異無統計學意義。染毒對照組和低、中、高劑量干預組在第1周染毒、第2周干預結束時的體重均顯著低于生理鹽水對照組（P<0.05）。見表1。

2.2 BALF中細胞分類計數和肺體比

與空白對照組比較，干預對照組、生理鹽水對照組大鼠BALF中的中性粒細胞百分比、肺體比均無顯著性差異。與生理鹽水對照組相比，染毒對照組大鼠BALF中的中性粒細胞百分比、肺體比均顯著升高（P<0.05）。與染毒對照組相比，低、中、高劑量干預組的中性粒細胞百分比均呈藥物劑量依賴性降低，差異亦有統計學意義（P<0.05）。各組大鼠肺泡灌洗液中的淋巴細胞百分比差異無統計學意義。與空白對照組比較，干預對照組、生理鹽水對照組大鼠肺體比差異均無統計學意義。與生理鹽水對照組比較，染毒對照組和低、中、高劑量干預組肺體比差異均有統計學意義（P<0.05）。低劑量干預組較染毒對照組的肺體比顯著性降低（P<0.05）。見表2。

2.3 BALF中各生化指標測定

本實驗通過對細胞毒性指標ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量的測定，觀察各組動物的肺部細胞和肺泡-毛細血管屏障損傷情況。干預對照組、生理鹽水對照組與空白對照組比較，BALF中的ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量差異均無統計學意義。與生理鹽水對照組比較，染毒對照組大鼠BALF中ACP、AKP、LDH活力和TP、ALB含量均顯著升高（P<0.05）。與染毒對照組比較，低、中、高劑量干預組大鼠BALF中的生化指標含量均呈藥物劑量依賴性降低。見表3。

2.4 BALF中炎癥損傷指標測定

本實驗通過對各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-ot、HS-CRP和IL-1β因子的測試，觀察各組動物的機體炎性損傷情況。干預對照組、生理鹽水對照組與空白對照組比較，BALF中的IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β濃度差異均無統計學意義。與生理鹽水對照組比較，染毒對照組大鼠BALF中IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β濃度均顯著升高（P<0.05）。與染毒對照組比較，低、中、高劑量干預組大鼠BALF中的IL-6、TNF-α、HS-CRP和IL-1β水平呈藥物劑量依賴性降低。見表4。

3討論

清肺抑火膠囊中多味中藥具有免疫抑制、抗炎和抗氧化的作用。黃芩的提取物對羥自由基、烷自由基等具有較強的清除功能，可提高腎組織中GSH、SOD的活性，具有抗腎組織纖維化的作用。梔子提取物可降低LPS誘導的大鼠腦膠質瘤細胞中TNF-α、IL-1β、細胞活性氧含量和NF-KB活性，具有一定的抗炎作用。天花粉可抗炎、抗病毒、降血糖。知母提取物可提高小鼠腦組織中抗氧化酶SOD活性，發揮抗氧化、抗衰老的作用，還可減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的合成，阻斷NF-KB的生成，具有抗炎作用。大黃可抑制大鼠體內炎癥因子的激活與釋放，具有明顯的抗炎作用。黃柏具有免疫抑制、抗炎和清除氧自由基的抗氧化作用。前胡具有舒張肺動脈高壓，改善心臟舒張功能，降低大腦動脈梗死大鼠血清中炎性細胞因子水平和抗腫瘤等功效。苦參的有效成分苦參堿可影響炎癥調節因子的水平，具有抗炎作用。桔梗具有祛痰鎮咳、清除氧自由基的抗氧化作用。

動物體重增長狀況可客觀地反映動物的生長發育和新陳代謝功能，可以作為PM_2.5暴露對動物健康影響的一項宏觀指標。本研究中，PM_2.5染毒導致大鼠體重增長低于正常水平，與用打印機墨盒內顆粒物染毒小鼠的研究結果相似。可能原因為，PM_2.5染毒引起大鼠機體炎癥反應等多種不適，導致食欲下降，同時大鼠自身要修復機體的損傷，需要消耗更多的能量和營養物質，最終影響大鼠的正常生長發育。

研究表明，顆粒物隨呼吸進入呼吸道和肺部以后，可通過氧化應激或炎癥損傷等機制破壞肺泡腔血管基底膜和毛細血管膜結構，改變肺泡細胞膜形態結構和功能，增加細胞膜通透性，導致細胞內各種蛋白酶等內容物漏出。ACP是一種主要存在于巨噬細胞的溶酶體酶，可參與機體的防御反應，當巨噬細胞吞噬異物裂解死亡后，就會有大量的ACP從巨噬細胞釋放到肺泡灌洗液中。AKP主要由肺泡Ⅱ型細胞產生，其含量多少提示肺泡Ⅱ型細胞受損程度。LDH是一種廣泛存在于機體各組織細胞中的胞漿酶，肺泡腔內的LDH主要來源于肺泡細胞損傷后滲漏和血液滲漏，肺泡腔內LDH水平可反映肺組織細胞膜受損程度，是一種反映細胞毒性的指標。肺部毛細血管通透性增加后，會有大量的TP、ALB滲出到肺泡腔，肺泡灌洗液中TP、ALB含量的多少可反映肺泡上皮一毛細血管通透性情況。本實驗結果表明，染毒對照組中細胞毒性指標（ACP、AKP、LDH活性和TP、ALB含量）均高于生理鹽水對照組，表明PM_2.5染毒可能會增加肺泡細胞膜和肺泡上皮一毛細血管膜通透性，導致細胞內各種蛋白酶等內容物漏出，對肺泡細胞產生毒作用。各劑量干預組肺泡灌洗液內細胞毒性指標水平均呈藥物劑量依賴性降低，提示清肺抑火中藥對PM_2.5引起的肺組織毒性損傷有一定改善作用。

呼吸道是大氣PM_2.5直接作用的靶器官，大氣PM_2.5暴露會引起實驗動物肺泡灌洗液中的中性粒細胞百分比、單核細胞數升高，引起炎癥反應。目前研究表明，與顆粒物引起呼吸道炎癥有關的細胞因子包括IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、INF等。TNF-α是前炎癥因子，可促進內皮細胞的黏附作用、白細胞的遷移，以利于細胞向炎癥部位遷移而增強其毒性作用。也有研究認為，肺泡灌洗液中TNF-α釋放量增加可能是肺纖維化疾病診斷的早期敏感標志。IL-6表達水平的變化是機體早期炎癥反應的敏感指標，IL-6主要由單核一巨噬細胞、血管內皮細胞合成，具有多種生物活性，可誘導CRP等急性期反應蛋白的合成，加強其他細胞因子（如INF、IL-1）的效果，參與炎癥反應。IL-1β是重要的前炎癥因子，可刺激IL-8等多種趨化因子的產生，募集炎癥細胞，擴大機體的炎癥反應。HS-CRP是一種急性相反應中重要的蛋白，可上調細胞黏附因子和單核細胞趨化因子水平，增強內皮細胞的黏附作用，參與局部或全身炎癥反應。當有炎癥存在時，HS-CRP水平會急劇升高，是機體炎癥反應的一個敏感指標。流行病學研究表明，大氣顆粒物污染會導致機體內CRP水平的升高。本實驗中，染毒對照組的肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6、IL-1B、TNF-α、HS-CRP含量和中性粒細胞百分比均高于生理鹽水對照組，表明PM_2.5染毒可以升高大鼠機體內細胞因子水平，引發炎癥反應，與夏萍萍等研究結果一致。各劑量干預組中，細胞炎癥因子水平和中性粒細胞百分比均呈一定程度的藥物劑量依賴性降低，表明清肺抑火中藥對PM_2.5染毒引起的肺組織炎癥反應有一定程度的減輕，也提示清肺抑火中藥可能是通過改變炎性因子的釋放量來干預PM_2.5導致的肺組織損傷。清肺抑火中藥對PM_2.5所致的大鼠急性肺部損傷具有一定的緩解作用，其可能的機制為通過降低PM_2.5對肺部的細胞損傷和炎癥損傷發揮作用，這與清肺抑火中藥的免疫抑制、抗炎和抗氧化等功效具有密切關系。