反向遺傳技術與豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗

李永霞/中農威特生物科技股份有限公司

反向遺傳學是相對于經典遺傳學而言的。經典遺傳學的認知路線為由表及里，是從生物體自身的性狀、表型出發到它的遺傳物質來研究生命的發生和發展規律。而反向遺傳學則與經典遺傳學恰恰相反，是一條由里及表的認知路線，其首先是獲得生物體基因組的全部序列，然后對靶基因有目的地進行加工和修飾，如基因插入、基因缺失、基因置換及定點突變等，再按組成順序構建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個體，研究生物體基因組的結構與功能，以確定這些變化對表型性狀的直接影響，與之相關的技術為反向遺傳技術。

反向遺傳技術在生命科學的各個領域應用廣泛，且在疫苗研發方面已顯示出重要的作用。該技術的問世和發展為生產合適的疫苗株提供了可能，其原因有以下幾個方面，第一：相比于傳統疫苗株的篩選方法，反向遺傳技術改造基因進而獲得的疫苗株更直接且更合理；第二：該技術能夠消除那些非允許細胞系分離毒株可能帶來的污染或其他病原體；第三：通過操作質粒，能夠改造影響病毒毒力的基因，去除那些致病因素，進而提高疫苗及疫苗生產的安全性。疫苗免疫依然是防控大部分動物疫病的最有效手段，反向遺傳技術的應用為設計和改造疫苗發揮了巨大作用。

反向遺傳技術現已成功應用于禽流感、新城疫、口蹄疫等畜禽重大疫病的疫苗研究中，除口蹄疫疫苗外具有代表性的產品有三例：一是重組禽流感病毒滅活疫苗(H5N1亞型，Re-1株)，2005年獲得一類新獸藥注冊證書（（2005）新獸藥證字3號）；二是利用新城疫LaSota弱毒疫苗反向遺傳系統，構建表達不同H5高致病力禽流感病毒HA抗原的重組病毒，成功研制禽流感、新城疫重組二聯活疫苗（rL-H5株），2007年獲得一類新獸藥注冊證書（(2007)新獸藥證字03號）；三是重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株），2014年獲得一類新獸藥注冊證書（（2014）新獸藥證字40號，農業部公告第2169號），其為防控畜禽疫病做出了卓越的貢獻。本文主要介紹反向遺傳技術在研發口蹄疫疫苗中的應用。

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性，且可快速遠距離傳播的動物疫病。侵染對象是豬、牛、羊、駱駝等主要畜種及其他家養和野生偶蹄動物，易感動物多達70余種。發病動物的主要癥狀是精神沉郁、流涎、跛行、臥地，近查可見口、鼻、蹄和母畜乳頭等無毛部位發生水皰，水皰破損后形成潰瘍或斑痂。口蹄疫的發病率高，可造成巨大的經濟損失和社會影響。該病為世界動物衛生組織法定報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。目前，口蹄疫仍然在世界許多地區流行，實踐證明有效的疫苗免疫能夠控制口蹄疫大范圍的暴發和流行。世界動物衛生組織和泛美口蹄疫中心肯定滅活疫苗免疫是當前防控口蹄疫的最有效手段。中國政府對口蹄疫的防控一直高度重視，有健全的組織機構與防控體系，長期堅持實施 “預防為主、免疫和撲殺相結合”的綜合防控措施，取得了舉世公認的成效。

反向遺傳技術在口蹄疫疫苗中的應用起源于2009年A型口蹄疫Sea-97疫情。2009年，A型口蹄疫Sea-97毒株由東南亞跨區域傳播至中國、韓國、蒙古、俄羅斯、朝鮮等東亞和東北亞國家，引起大流行，全世界為之矚目。世界口蹄疫參考實驗室利用國際疫苗毒株庫儲備疫苗株與之抗原匹配性試驗，其匹配值均低于國際標準，無合適疫苗株可推薦。與此同時，國內外有關疫苗研發單位對該流行毒分離株也開展了疫苗種毒馴化篩選工作，但都因病毒產量低、免疫效力差而沒有成功。

口蹄疫病毒為單股正鏈 RNA病毒，基因組全長約 8500個核苷酸(nt) ，由5′端非編碼區(5′-UTR)、開放閱讀框( ORF)和 3′-UTR 及 Poly( A)尾巴組成。 5′-U TR長約1200 nt，含有S片段、Poly(C)和IRES 等，并在其 5′末端連有一個 VPg。ORF由L基因、P1 結構蛋白基因、P2和P3非結構蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，長約 6.5 kb，編碼一個大的聚合蛋白。此蛋白隨后被逐級降解為病毒所需的各個組分 L/L′，P1(1A、1B、1C和1D)、 P2(2A、2B和2C)和 P3(3A、3B、3C 和 3D)。3′U TR 長約 92 nt。Poly(A)尾巴長約100 nt。

疫苗研發團隊通過全基因信息解讀發現，A型Sea-97毒株3'端非編碼區（3'UTR）莖環發生了突變，用單質粒病毒拯救系統證實，該突變將導致病毒在細胞（BHK-21）內的復制水平大幅度降低，從而解釋了田間分離的A型Sea-97毒株細胞繁殖力低難以馴化為疫苗毒的原因。其后，該團隊利用高復制力型的3'UTR和3D基因構建了制苗種毒拯救框架，同時對A型Sea-97毒株結構蛋白P1基因進行突變修飾，改變了影響病毒結構穩定性的關鍵氨基酸編碼，并將其克隆至上述病毒拯救框架，制備出Sea-97株重組病毒Re-A/WH/09，其病毒抗原產量提高2.25～6.67倍，抗原穩定性提升1倍以上，對A型Sea-97 G1分支毒（A/WH/09）和G2分支（A/GDMM/2013）病毒的匹配性高，抗原關系r值分別為0.94±0.12和0.68±0.06（OIE規定當r≥0.3視為抗原匹配）。

Re-A/WH/09毒株不僅解決了A型口蹄疫Sea-97流行毒的防控問題，同時也解決了世界動物衛生組織（OIE）疫苗毒株庫缺少可與Sea-97流行毒匹配的疫苗株問題。2013-2017年，被OIE口蹄疫參考實驗室推薦使用。有力推動了口蹄疫疫苗的科技進步，已獲得了甘肅專利一等獎（2015）和中國專利優秀獎（2016）。

由此可見，利用反向遺傳技術構建疫苗種毒是口蹄疫疫苗創制技術的重大創新和發明，能夠解決常規技術難以解決的問題，為繼續提升制苗種毒多種性能（如提升產能、誘導早期免疫應答、延長免疫保護期、降低和消除致病性和免疫抑制等）和創制更高效疫苗奠定堅實的基礎，將使我國的畜禽疫苗技術躍居國際領先水平。

在成功構建A型疫苗種毒的基礎上，疫苗研發團隊利用制苗種毒拯救框架對O型Mya-98病毒進行了改造和提升。再通過L、5'UTR和P12A等基因修飾，減弱其致病性，制備出針對O/Mya-98株的重組病毒Re-O/MYA98/JSCZ/2013。該重組疫苗毒的病毒產量明顯提高，對家畜致病性減弱，抗原針對流行毒株，提高了疫苗生產效率、免疫效力和疫苗及疫苗生產的安全性。

由中國農業科學院蘭州獸醫研究所和中農威特生物科技股份有限公司等單位聯合成功研制的豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）已于2017年12月11日獲得“一類新獸藥注冊證書（證號：（2017）新獸藥證字56號）。中農威特生物科技股份有限公司已于2018年2月23日獲得了豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）的獸藥產品批準文號，不日產品即可面市。豬口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）是國內外首例使用反向遺傳技術定向設計和優化構建疫苗種毒的豬用口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗，本疫苗生產和推廣使用，對穩定國內O型口蹄疫疫情，防止豬A型口蹄疫疫情間歇性反彈，實現免疫無疫要求等方面具有重要意義。該疫苗的問世，將徹底解決無豬用A型口蹄疫疫苗的歷史，有力地支撐了國家防控需求。對規模豬場和養殖戶來說，是一場及時雨，不僅有了高效豬用口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗，而且還得到了農業部的官方許可。該疫苗具有以下優勢：

（1）具有良好的免疫原性和免疫效力。重組毒株制備的疫苗免疫的宿主抗體應答早且高。

（2）拓寬了疫苗種毒的抗原譜。通過構建重組表位，拓寬抗原譜，提高交叉保護性，可有效防控目前我國現有A型和O型流行毒株。

（3）提高了抗原產能和穩定性。制苗種毒Re-A/WH/09株和Re-O/MYA98/JSCZ/2013株在生產用懸浮BHK-21細胞上很好的生長，抗原產能提高3～10倍。抗原穩定性提高1～3倍。

（4）提高了生物安全性。重組制苗種毒的致病性減弱，從而降低了疫苗及疫苗生產的過程中生物安全風險。

綜上所述，反向遺傳技術在口蹄疫疫苗的研發方面已取得了很大的突破，其是疫苗研制方面強有力的工具和手段，將會在此方面發揮更大的作用。