不同方法學測定乙型肝炎病毒核心抗體的陽性率及其定量檢測意義的研究

王紅翠 林健聰 吳英松 董志寧 李志雄★

人體感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）后最先產生的抗體為乙型肝炎病毒核心抗體（hepatitis B virus core antibody，anti?HBc），在HBV感染早期即可在血清中檢測到，常持續存在終身［1］。目前，anti?HBc常用的檢測方法有酶聯免疫吸附測定法（enzyme?linked immunosorbent as?say，ELISA）、時間分辨免疫分析法、化學發光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等。其中，傳統的ELISA方法，通常會將不稀釋樣本的檢測結果作為流行病學調查，而將標本稀釋檢測的結果用于臨床診斷，但據張碧瑩等［2］的研究顯示，ELISA稀釋法檢測低濃度anti?HBc時，易呈假陰性。據文獻的報道可知，不同地區的正常人群中，anti?HBc的陽性率不一樣，且普遍呈現陽性率高的狀況［3?4］。僅從定性方面檢測 anti?HBc并不能很好的解釋它的臨床意義。有研究顯示，早期（30歲之前）發生HBeAg血清轉換且HBV DNA持續檢測不到的慢性乙肝患者，臨床癥狀得到顯著改善，肝纖維化可以逆轉［5］。

本研究選用臨床檢測性能較好的CLIA試劑盒作為對比試劑，與ELISA試劑盒的稀釋法、不稀釋法同步測定標本的anti?HBc濃度，分析不同方法學測定 anti?HBc的陽性率，以探討 anti?HBc檢測試劑的性能。同時從定量角度探討其不同濃度水平的臨床意義，通過對HBeAg陽性慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者的anti?HBc、HBeAg濃度水平進行跟蹤研究，以探討anti?HBc定量測定的臨床意義，并期望對乙型肝炎的治療、預后觀察有一定的參考意義。

1 對象與方法

1.1 對象

隨機選取健康查體者的病例400例，年齡在20～60（32±11.54）歲之間，男性 272例，女性 128例，采集血清標本，共400例標本。另外選取97例CHB 患者（anti?HBc、HBeAg、HBsAg臨床檢測均為陽性的患者，即大三陽患者），年齡在15～73（39±13.62）歲之間，男性69例，女性28例，采集其抗乙肝病毒治療前后的血清標本，共194例有效標本。所有標本均來源于福建福州傳染病醫院。

1.2 儀器與試劑

雅培貿易（上海）有限公司（以下簡稱“雅培公司”）的全自動免疫分析儀ARCHITECT i2000sr及配套的anti?HBc測定試劑盒、校準品和專用質控品。廈門優邁科醫學儀器有限公司的全自動化學發光免疫分析儀Caris200，配套廣州市達瑞生物技術股份有限公司（以下簡稱“達瑞公司”）的anti?HBc測定試劑盒和HBeAg測定試劑盒及專用的質控品。上海科華生物工程股份有限公司（以下簡稱“科華公司”）的anti?HBc檢測試劑盒及質控品，配套BIO?RAD公司的酶標儀PR 4100。

1.3 方法

1.3.1 試劑定標

根據雅培公司和達瑞公司的anti?HBc測定試劑盒的要求，使用定標品進行定標，定標合格后，再進行下一步的檢測操作。每天進行測試前先測定質控品濃度，保證定標曲線的可靠性。科華公司的anti?HBc檢測試劑盒，根據說明書的要求，每次實驗使用對照品進行定標，并測定質控品，以保證實驗的可靠性。

1.3.2 標本采集

對于隨機抽取的400例健康查體者，經其本人同意將體檢檢測的剩余標本用于科研研究后，采集檢測剩余的血清標本2 mL，于2～8℃短期保存，-20℃長期儲存。將在醫院進行抗病毒治療的CHB患者納入研究，在獲得病人同意的情況下，采集藥物治療前檢測剩余的血清標本2 mL，經3個月治療后，再次采集檢測剩余的血清標本2 mL，其中排除除了抗病毒藥物治療還進行其他治療的患者、標本采集相隔時間不是3個月的患者、未取得知情同意的患者后，共有97例CHB患者，共194份標本，于2～8℃短期保存，-20℃長期儲存。

1.3.3 標本檢測

分別采用雅培公司、達瑞公司和科華公司的anti?HBc試劑盒對400例健康查體者的標本進行同步測定，統計分析各試劑盒檢測anti?HBc的陽性率。

使用雅培公司、達瑞公司和科華公司的anti?HBc試劑盒和達瑞公司的HBeAg測定試劑盒，對97例臨床CHB患者藥物治療前后收集的共194份血清標本進行檢測，并分析評價藥物治療前后anti?HBc和HBeAg的濃度變化。

所有實驗操作過程，嚴格按照各公司試劑盒的說明書進行。

1.4 統計分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理與統計分析，計數資料以百分率表示；CHB患者在藥物治療前后anti?HBc濃度變化的比較，采用配對t檢驗統計分析；評價不同anti?HBc濃度水平治療前后HBeAg的血清學轉換率，采用卡方檢驗統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同廠家試劑檢測anti?HBc的陽性率比較

對于CHB患者在治療前后收集的共194份血清標本，達瑞公司與其他兩家公司的anti?HBc試劑盒檢測結果均為陽性，其陰陽性符合率為100.0%，統計結果詳見表1。

表1 CHB患者治療前后anti?HBc的陰陽性結果統計表（n）Table 1 The results of anti?HBc before and after treatment of CHB patients（n）

對隨機選取400例健康查體者標本進行anti?HBc檢測，達瑞公司與雅培公司的陰陽性符合率為100.0%；科華生物（標本1∶30稀釋）與雅培公司的陽性符合率為35.71%，陰性符合率為100.0%，總符合率為73.0%；科華生物（原倍檢測）與雅培公司的陽性符合率為100.0%，陰性符合率為63.21%，總符合率為63.0%，統計結果見表2。不同廠家之間的符合率結果詳見表3。

表2 健康查體者的anti?HBc陰陽性結果統計表（n）Table 2 The statistics of anti?HBc results of healthy testing groups（n）

2.2 抗病毒治療中的anti?HBc水平及其預測意義

2.2.1 CHB患者治療前后的anti?HBc濃度變化

采用達瑞anti?HBc測定試劑盒對97例CHB患者抗病毒治療前后的標本進行測定，并對CHB患者治療前后的anti?HBc濃度水平進行配對t檢驗，檢驗結果見表4。結果顯示在抗病毒治療前后，CHB患者的anti?HBc濃度無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 健康查體者的anti?HBc檢測符合率統計表Table 3 The coincidence rate of anti?HBc results of healthy testing groups

表4 CHB患者治療前后anti?HBc濃度變化配對t檢驗Table 4 The result of t?test pairs of anti?HBc before and after treatment of CHB patients

2.2.2 CHB患者治療前后的HBeAg陽性率變化

采用達瑞HBeAg測定試劑盒對97例CHB患者在抗病毒治療前后的標本進行測定，統計分析結果見表5。結果顯示，97例HBeAg陽性的CHB患者經過治療后，有11例患者發生了HBeAg血清學轉換，即HBeAg變為陰性，血清學轉換率為11.34%。

2.2.3 不同anti?HBc濃度水平的患者在治療前后HBeAg陽性率的變化

根據達瑞anti?HBc定量試劑盒測定CHB患者治療前標本的anti?HBc濃度水平，將97例CHB患者標本分成anti?HBc高濃度（≥9 000 IU/mL）和an?ti?HBc低濃度（＜9 000 IU/mL）兩組，對比兩組患者的HBeAg血清學轉換率，結果顯示anti?HBc高濃度組（≥9 000 IU/m）的患者經過治療后，其HBeAg血清學轉換率為20.83%；anti?HBc低濃度組（＜9 000 IU/mL）的患者經過治療后，其HBeAg血清學轉換率為2.04%。經卡方檢驗，anti?HBc高濃度組HBeAg血清學轉換率比anti?HBc低濃度組的明顯增高，具有統計學意義（P＜0.05）。結果詳見表6、表7所示。

表5 CHB患者治療前后HBeAg陰陽性的變化情況Table 5 The results of HBeAg before and after treatment of CHB patients

表6 anti?HBc高低濃度組間治療前后HBeAg發生血清學轉換的統計Table 6 The results of HBeAg seroconversion between high and low anti?HBc concentration groups

3 討論

HBcAg主要存在于肝細胞內和血清Dana顆粒中，與anti?HBc具有很強的親和力，能迅速結合形成免疫復合物，故難以在血清中測得游離的HBcAg，所以臨床上以檢測anti?HBc來間接反映HBcAg的水平［6］。由于HBcAg較HBV表面抗原有更高的免疫原性，故anti?HBc較其他HBV抗體更早產生，并且有更高的血清水平，以及更長久的存在時間，無論肝病是否存在或病毒已否消除，anti?HBc 可持續存在數十年，因此 anti?HBc 成為了臨床診斷HBV與流行病學調查最有價值的血清標志物之一［7］。作為流行病學調查的標志物之一，不同地區、不同年齡段的人群，其anti?HBc檢測的陽性率均有所差異，此外檢測的方法學和試劑，也是影響其檢測陽性率的重要因素［8?9］。

表7 anti?HBc高低濃度組間治療前后HBeAg血清學轉換的卡方檢驗Table 7 The chi?square test of HBeAg seroconversion between high and low anti?HBc concentration groups

在本次研究中，使用兩種CLIA的檢測試劑盒、一種ELISA的檢測試劑盒，對400例健康查體者的標本進行了anti?HBc檢測，其中達瑞公司與雅培公司的陽性率均為42.0%，陰陽性符合率為100.0%，說明兩家公司anti?HBc試劑盒的檢測結果符合率高，具有很高的一致性。另外，本研究的實驗結果顯示，科華公司的ELISA法anti?HBc檢測試劑盒，其測定不稀釋的健康查體者標本時，anti?HBc的陽性率為79.0%，比CLIA試劑盒的更高，而測定經過稀釋的健康查體者標本時，其陽性率為15.0%，比CLIA 試劑盒的低，該結果與陸盈［10］、汪詠新等［11］等的研究結果一致。以雅培公司的檢測結果作為測定anti?HBc的金標準，則達瑞公司的檢測結果與雅培公司一致，ELISA試劑盒測定不稀釋的標本時，假陽性率較高，測定稀釋標本時，出現漏檢率較高。對于該情況，李金明［12］教授提出一種理論，認為anti?HBc的假陽性，可能是由血清（漿）中存在交叉反應性抗體或干擾物質導致的，如前母B淋巴細胞的非特異激活，導致未感染HBV的IgA或IgM相關分子的產生，可能會導致anti?HBc假陽性。在這種情況下，使用還原劑，如二硫蘇糖醇、重亞硫酸鉀和半胱氨酸等預處理血清標本將明顯改善anti?HBc檢測的特異性。其中雅培公司、達瑞公司的anti?HBc測定試劑盒，均需要對標本進行預處理，本研究中使用其測定健康查體者的陽性率均為42.0%，明顯低于無預處理的ELISA anti?HBc試劑盒測定不稀釋標本的79.0%，高于測定稀釋標本的15.0%。由于雅培公司的檢測結果更受國內外市場的認可，故臨床上建議選用與雅培公司測值符合率較高的國產CLIA anti?HBc試劑盒，以降低ELISA anti?HBc試劑盒測定不稀釋標本的假陽性率和測定稀釋標本的漏檢率。

根據《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）［13］的指導意見，HBeAg陽性患者，藥物治療的滿意終點是停藥后獲得持續的病毒性應答，谷丙轉氨酶復常，并伴有HBeAg血清學轉換，故本研究對97例CHB患者的anti?HBc水平和HBeAg水平進行了跟蹤檢測，結果顯示在抗病毒治療前后，CHB患者的anti?HBc濃度無顯著性差異（P＞0.05）；97例HBeAg陽性的CHB患者經過治療后，HBeAg血清學轉換率為11.34%，anti?HBc高濃度（≥9 000 IU/mL）組的HBeAg血清學轉換率為20.83%，明顯高于anti?HBc低濃度（＜9 000 IU/mL）組的2.04%，該差異具有統計學意義（P＜0.05）。故通過測定HBeAg陽性CHB患者的anti HBc水平，可預測患者抗病毒藥物治療的效果，anti?HBc濃度高（≥9 000 IU/mL）的患者，其HBeAg血清學轉化率高，抗病毒藥物的治療效果更好；而低濃度anti?HBc（＜9 000 IU/mL）的患者，HBeAg血清學轉化率低，對治療不敏感。據袁權、Fan 等［1，14?16］的報道，在接受ADV和PegIFN治療的HBeAg陽性病人中，基線anti?HBc水平能有效預測治療后HBeAg血清學轉換應答情況，基線anti?HBc水平高的病人（ADV治療病人≥29 000 IU/mL；PegIFN治療病人≥9 000 IU/mL）較基線anti?HBc水平低者治療后（隨訪終點）HBeAg血清學轉換率更高。該研究結果與本研究的發現一致，本研究進一步驗證了anti?HBc這一經典HBV血清學指標的定量檢測，對HBeAg陽性CHB患者的藥物治療效果有預測作用，對anti?HBc的進一步臨床應用、CHB患者的治療和預后觀察有著重大的意義。

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