塞來昔布對創傷性異位骨化模型大鼠的BMP—4影響

柳明忠　曾榮東　張志珊　鄭錦陽

[摘要]目的為探究塞來昔布對創傷性異位骨化大鼠模型的BMP-4的影響。方法該研究于2016年5月-2017年4月給予該院建立的創傷性異位骨化模型大鼠予喂食塞來昔布，分別采取喂食2周、6周、10周的不同方案，通過實時定量PCR及western blot實驗，檢測模型大鼠跟腱組織BMP-4的表達含量。結果塞來昔布處理后大鼠，實時定量PCR及western blot顯示：相比于生理鹽水處理大鼠，塞來昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達明顯下調，并且隨著塞來昔布處理時間的延長，BMP-4的表達也相應的下調。結論塞來昔布可通過降低大鼠跟腱組織BMP-4的表達以干預異位骨化

[關鍵詞]塞來昔布；異位骨化；BMP-4

[中圖分類號]R285 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-0742（2017）10（a）-0018-04

臨床上將骨組織以外發生的骨化稱為異位骨化（Heterotopic ossification，HO），其本質是一種以局部纖維組織增生、鈣化、化生及伴有異位新骨形成為主要病理特征的非腫瘤反應性病變。主要發病人群為肘關節、髖關節外傷患者，發生后會導致患者出現關節強直、僵硬等癥狀，關節活動度明顯受限，對患者生活和工作造成影響。因此，如何防治異位骨化，已經成為廣大相關骨科工作者的重要課題。骨形態發生蛋白（bone nor.phogenetio protein，BMP）是誘導異位骨化的主要活性介質。主要參與骨骼的生長、發育及創傷的修復，其作用的靶細胞是未分化的、有活性的間充質細胞，對肌肉、血管周圍間充質細胞具有誘導作用，并能夠對軟骨細胞和骨細胞進行不可逆性的分化。1965年Urist等發現脫鈣的骨基質可以誘導異位骨化的形成，林霖等直接注射BMP-4重組腺病毒在裸鼠肌肉內成功誘導出異位骨化，提示BMP-4與異位骨化的發生關系密切。結合非甾體抗炎藥在異位骨化治療中扮演的重要角色，以及前期研究發現BMP-4在異位骨化進展中所起的重要作用，該研究于2016年5月-2017年4月給予該院建立的創傷性異位骨化模型大鼠予喂食塞來昔布來治療，分別采取喂食2、6、10周的不同方案，治療后觀察各組大鼠肢體的皮溫、腫脹程度及X線表現，并測定模型大鼠跟腱組織BMP-4的表達及其含量。從而為COX-2選擇性抑制劑臨床預防HO及使用療程提供實驗基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物

實驗動物：選取48只健康雄性wistar大鼠，體重均位于220～240g之間。所有大鼠均購買于山東大學動物實驗中心。

1.2主要試劑

美國Gibco公司生產的塞來昔布、美國santa公司生產的多克隆抗體、碧云天公司生產的蛋白酶抑制劑。

1.3實驗動物模型制備

將48只sD級體重（100+10）g大鼠，雌雄各半，隨機分為6組，每組各10只。右側為實驗組。各組大鼠均建立創傷性異位骨化模型，造模方法：給予大鼠腹腔注射2%氯胺酮進行麻醉，劑量為80～100mg/kg。麻醉成功后，將大鼠固定在手術臺上，對手術區域皮膚進行脫毛，并使用碘伏進行常規消毒，無菌手術刀片沿大鼠右跟腱縱行切開1cm皮膚切口，顯露跟腱止點，垂直切口方向橫行切斷近止點部跟腱，術后全層縫合切口。

1.4大鼠創傷性異位骨化模型的治療

術后第1天開始給藥，第1、3、5組大鼠均予塞來昔布10mg/（kg·d）喂食，第1組喂食2周，第3組喂食6周，第5組喂食10周，第2、4、6組分別喂食2mL生理鹽水2周、6周或10周。各組均灌胃1次，d，術后第1周隔天觀察1次，1周后每周觀察1次。

1.5大鼠創傷性異位骨化模型效果評價

對比各組大鼠術后10周的皮溫、腫脹程度，于麻醉狀態下拍攝各組大鼠右肢側位X線片，觀察各組大鼠是否有新骨形成。其中鑒于未有指南明確表明，以上指標的評判標準。②該研究擬：皮溫取所有實驗動物的皮溫平均值。腫脹程度：評分范圍0～3分，O分為無腫脹，1分為腫脹位于損傷點，2分為腫脹位于膝關節，3分為腫脹位于膝關節以上。新骨形成情況：評分范圍0～1分，0分為無新骨形成，1分為有新骨形成。③檢測各組大鼠術后10周跟腱組織中骨形態發生蛋白-4（BMP-4）的含量。

1.6骨形態發生蛋白-4（BMP-4）含量檢測

分別進行實時定量PCR檢測和western blot檢測。（1）實時定量PCR檢測：研究標本為大鼠跟腱組織，采集大鼠跟腱組織后，加入適量trizo，在零下20%的環境中孵育15min，以1200r/min的速度離心10min，在跟腱組織標本液中加入75%乙醇進行沉淀，使用DEPC水將沉淀物質溶解，放置于零下70%的冰箱中。之后進行總RNA反轉錄提取和熒光定量PCR反應，反應條件：①溫度95%、預變性、時間10min；②溫度95%、變性、時間15s；③溫度60%、退火、時間30s；④溫度72%、延伸、時間30s，共進行40個循環；⑤72℃末次延伸時間為5min。（2）western blot：收集大鼠跟腱組織，提取蛋白，測定濃度（BCA法），然后取等量蛋白上樣電泳，轉膜，封閉，加入抗大鼠BNP-4，在4℃條件下孵育過夜，孵育1h后加入二抗山羊抗小鼠IgG，經ECL化學發光顯色，內參為GAPDH。最后應用iomad western分析儀自動分析測定蛋白表達量。

1.7統計方法

統計分析軟件Graph Pad 6.0。不同組別間采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

塞來昔布可通過降低大鼠跟腱組織BMP-4的表達以干預異位骨化。

進一步為探究塞來昔布可明顯干預大鼠異位性骨化的具體機制，檢測了塞來昔布及生理鹽水處理大鼠異位骨化模型中跟腱組織中，與異位骨化顯著相關分子BMP-4的表達。在mRNA水平上，通過實時定量PCR檢測發現：相比于生理鹽水處理大鼠，塞來昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達明顯下調.并且隨著塞來昔布處理時間的延長，BMP-4的表達也相應的下調。為進一步確認BMP-4在塞來昔布影響異位骨化中的作用，我們采用western blot實驗，從蛋白角度出發，結果同樣顯示：比于生理鹽水處理大鼠，塞來昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達明顯下調，并且隨著塞來昔布處理時間的延長，BMP-4的表達也相應的下調。由上述內容可知，塞來昔布會導致大鼠跟腱組織中的BMP-4的表達含量減少，影響異位骨化的形成。