激光共聚焦顯微鏡的組成及使用維護(hù)

摘 要 介紹了激光共聚焦顯微鏡（FV1000MPE，Olympus）的組成和技術(shù)參數(shù)，并根據(jù)日常使用情況和積累的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了該套系統(tǒng)的使用及日常維護(hù)方法。

【關(guān)鍵詞】激光共聚焦顯微鏡 組成 使用及維護(hù)

激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）是20世紀(jì)80年代隨著光學(xué)、視頻、計(jì)算機(jī)等技術(shù)飛速發(fā)展而誕生的新一代顯微鏡，在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，LSCM使用單光子激光作為光源，采用共扼聚焦原理和裝置，利用計(jì)算機(jī)對觀察對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察、分析和輸出。可對樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，得到高分辨率的薄層光學(xué)切片（XY）；觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)，得到多維度成像結(jié)果（XYZ）；或完成樣品的長時(shí)間延時(shí)序列成像（XYT）。LSCM已成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。筆者根據(jù)多年以來在本單位大型儀器共享平臺上維護(hù)激光共聚焦顯微鏡（FV1000MPE，Olympus）的工作經(jīng)驗(yàn)，對該套系統(tǒng)的組成、使用和維護(hù)做出如下總結(jié)與交流：

1 激光共聚焦顯微鏡（FV1000MPE，Olympus）的組成和技術(shù)參數(shù)

1.1 激光光源

包括四個獨(dú)立的覆蓋可見光波長范圍的激光器（提供6個不同波長）：

（1）近紫外激光器：405nm，25mW，適用于DAPI、Hochest等染料以及FRAP等光刺激實(shí)驗(yàn)；

（2）多譜線氬離子激光器：458nm、488nm、515nm，30mW，適用于FITC、GFP、YFP、ALEX488等染料；

（3）綠色激光器：559nm，15mW，適用于PI、Texas等諸多染料；（4）紅色激光器：635nm，20mW，適用于CY5、CY5.5等染料。

采用AOTF型激光整合器，將各激光器發(fā)出激光整合后通過光纖傳輸至掃描裝置，使不同激光器作為一個整體工作。按需要控制激光在樣品掃描中的強(qiáng)度，強(qiáng)度調(diào)節(jié)范圍是0.1%-100%，0.1%精度步進(jìn)，實(shí)現(xiàn)任意區(qū)域內(nèi)的激光強(qiáng)度控制和波長選擇。

1.2 掃描單元

后置式掃描單元，光譜型共聚焦熒光探測器，內(nèi)置3個獨(dú)立光電倍增管熒光探測通道（PMT），其中包括兩個光譜通道和一個自動濾色片通道。提供CH1和CH2通道精確的光譜掃描功能，采用光柵分光、狹縫收集。配備3個熒光通道，及1個透射光通道用于記錄微分干涉圖像（DIC）。通過軟件控制可實(shí)現(xiàn)多種掃描方式，除X、Y、Z、T任意組合等常規(guī)掃描方式外，還支持點(diǎn)掃描、線掃描（直線和任意曲線）、矩形掃描、雙向掃描、序列掃描、Zoom 1×—50×（局部放大掃描）等擴(kuò)展掃描方式。

1.3 倒置熒光顯微鏡

倒置研究級電動顯微鏡-IX81主機(jī)，包括電動載物臺、6位物鏡轉(zhuǎn)盤及100%光路轉(zhuǎn)換器。10×、20×低倍物鏡、40×油鏡（NA=0.95）、超級色差校正物鏡60×油鏡（NA=1.35），100×油鏡（NA=1.4）均具有微分干涉（DIC）拍攝功能。以上物鏡能夠兼顧生物樣本的熒光及DIC觀察拍照。

1.4 活細(xì)胞恒溫培養(yǎng)系統(tǒng)

配備高級焦點(diǎn)防漂移ZDC和系統(tǒng)適配器，活細(xì)胞培養(yǎng)小室可保持恒定CO2、溫度和濕度，保證培養(yǎng)皿內(nèi)活細(xì)胞能進(jìn)行長時(shí)間的延時(shí)序列成像。

2 激光共聚焦顯微鏡操作規(guī)程

標(biāo)準(zhǔn)開關(guān)機(jī)流程（所有硬件設(shè)備需要先開開關(guān)、后開鑰匙）：

（1）開啟電動顯微鏡控制器：IX2-UCB；

（2）開啟汞燈電源：U-RFL-T （開啟半小時(shí)內(nèi)不能關(guān)閉）；

（3）開啟電動載物臺控制器：PRIOR；

（4）開啟主掃描單元控制器：MAIN-PSU；

（5）開啟SIM掃描單元控制器：SIM；

（6）開啟488多線氬離子激光器電源；

（7）開啟559激光器電源（兩個綠燈都亮?xí)r，開啟鑰匙，稍后等兩個紅燈都點(diǎn)亮?xí)r，激光出光穩(wěn)定，此時(shí)可使用559激光）；

（8）開啟405/635/AOFT電源控制器：FV10-MCPSU；

（9）開啟電腦；

（10）開啟軟件FV10-ASW；

（11）獲取圖像：使用倒置熒光顯微鏡觀察生物樣本，找到觀察區(qū)域，關(guān)閉顯微鏡熒光光閘（shutter），使用激光進(jìn)行掃描預(yù)覽，采用Focus×2鍵快速預(yù)覽，調(diào)整激光器（Laser）輸出功率、探測器靈敏度（HV）、光電倍增管增益（gain）、降噪（offset）等，以達(dá)到最佳成像效果。為防止熒光串色，選用順序掃描模式（seqential），降低掃描速度，并選用kalman去噪模式，獲取圖象并保存；

（12）關(guān)機(jī)（所有硬件先關(guān)鑰匙，后關(guān)開關(guān)）：先關(guān)軟件和電腦，再關(guān)閉各個硬件控制器。注意：488多線氬離子激光器電源鑰匙關(guān)閉之后，等待5-10分鐘，再關(guān)閉開關(guān)（以保證風(fēng)扇繼續(xù)工作5-10分鐘，保證儀器散熱）。

3 激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的日常管理與維護(hù)

“工欲善其事，必先利其器”，激光共聚焦顯微鏡作為使用率極高的大型精密儀器，它的正常運(yùn)轉(zhuǎn)離不開科學(xué)的日常管理及養(yǎng)護(hù)。

3.1 儀器負(fù)責(zé)人管理制度

為激光共聚焦顯微鏡指定儀器負(fù)責(zé)人，由專人負(fù)責(zé)儀器的開關(guān)機(jī)，規(guī)范的開關(guān)機(jī)對于儀器，尤其是激光器及汞燈的維護(hù)極為重要，并由負(fù)責(zé)人每天檢查儀器的運(yùn)行狀態(tài)。

3.2 儀器預(yù)約使用

激光器和汞燈均屬于耗材性的配件，使用壽命有限。尤其是激光器，價(jià)格昂貴，在幾萬至幾十萬元不等。充分利用好儀器的開機(jī)時(shí)間，避免儀器空轉(zhuǎn)顯得格外重要。本中心要求使用人員通過儀器共享平臺的網(wǎng)絡(luò)預(yù)約，依次按序預(yù)約使用儀器。一旦出現(xiàn)超過半小時(shí)以上的空檔時(shí)間，由儀器負(fù)責(zé)人及時(shí)協(xié)調(diào)儀器使用，通知預(yù)約較晚時(shí)間點(diǎn)的人員提前使用，避免儀器開機(jī)空轉(zhuǎn)造成的浪費(fèi)。

3.3 使用光盤或者網(wǎng)盤保存數(shù)據(jù)

嚴(yán)禁插拔U盤或者硬盤拷貝數(shù)據(jù)，使用儀器共享管理系統(tǒng)的網(wǎng)盤傳輸或者光盤刻錄數(shù)據(jù)結(jié)果，杜絕病毒侵染激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)。

參考文獻(xiàn)

[1]王珺，王燕，龔堅(jiān)，唐微.激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用技術(shù)[J].現(xiàn)代儀器，2009，15（04）：50-52.

[2]尹偉，肖貴鳳，劉雙雙，吳航軍，孫啟才.倒置激光共聚焦顯微鏡的共享使用與維護(hù)[J].生命科學(xué)儀器，2015，13（06）：46-49.

作者簡介

王文潔（1984-），女，江蘇省南京市人。碩士。博士在讀，助理研究員。研究方向?yàn)榉派渖飳W(xué)，實(shí)驗(yàn)室管理。

作者單位

蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心 江蘇省蘇州市 215123