耐冷嗜酸硫桿菌的生長特性和固定化培養

陳 鵬 王清良 胡鄂明 李 乾 劉天印 陳 寬

(1.南華大學核資源工程學院，湖南 衡陽 421001；2.核燃料循環技術與裝備協同創新中心，湖南 衡陽 421001)

浸鈾菌種多為中溫菌，最適宜的生長溫度為25～40 ℃[1-3]。因而，在新疆地區進行細菌浸鈾就面臨著巨大的挑戰。李聰等[4]對新疆伊犁河谷地區近50 a來的氣候研究表明：該地區春季平均氣溫為9.9 ℃，夏季平均氣溫為20.5 ℃，秋季平均氣溫為8.6 ℃，冬季平均氣溫為-7 ℃。另據現場觀測，伊犁河谷地區某鈾水冶車間吸附尾液溫度在10～17 ℃，中溫菌在此類尾液中會出現生長活性不高，氧化Fe2+速率慢等情況，嚴重時甚至出現細菌生長和繁殖停止等問題，以至于細菌浸鈾技術未能在新疆酸法地浸采鈾礦山推廣應用。

針對上述問題，本試驗采用耐冷嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillusferrivorans簡稱A.ferrivorans)作氧化劑，該菌具有好氧嗜酸特性，可在5～30 ℃生長繁殖[5-6]。M.Liljeqvist等[7]指出，A.ferrivorans是一種嗜酸菌，通過氧化Fe2+和硫化物獲取能量，并從二氧化碳獲得有機碳。A.Amouric等[8]對A.ferrivorans的運動性、鞭毛的有無、基因差異性等特征進行了詳細研究。S.Christel等[9]利用RNA轉錄測序揭示了A.ferrivorans對無機硫化合物的氧化途徑。C.González等[10]通過基因組分析了A.ferrivorans的遺傳變異性，為細菌應用于生物冶金以及含硫廢水的處理提供理論依據。Pinar Aytar等[11]從某礦山酸性廢水中分離純化了一株嗜酸硫桿菌，經16S rRNA基因測序和做系統發育樹，得出該菌是一株A.ferrivorans，并且具有較強的脫硫效果以及氧化Fe2+能力。R.Ccorahua 等[12]從秘魯某銅礦山酸性礦坑中分離純化出一株A.ferrivorans，并研究了該菌浸礦的最適宜溫度、pH以及生長動力學，表明該菌具有較好的應用前景。劉敏瑞等[13]采用16S rRNA 基因、RubisCO功能基因序列分析篩選來自新疆富蘊縣的A.ferrivorans，表明A.ferrivorans與其棲息環境有一定的聯系。余水靜等[14]利用生物信息學方法鑒定和分析了一株A.ferrivorans的雙組分信號轉導系統(TCS)結構特征，表明A.ferrivorans具有嗜酸硫桿菌共有的TCS功能，如氮素固定及代謝調節、檸檬酸蘋果酸代謝調節等，而特有的TCS功能涉及趨化性調控、重金屬響應等。趙永紅等[15]利用生物信息學方法挖掘出A.ferrivorans與其他嗜酸硫桿菌共49個抗砷基因，發現一些抗砷基因為嗜酸硫桿菌所共有，說明這類基因是嗜酸硫桿菌抗砷所必需的基因，有助于A.ferrivorans適應極端環境。莫曉蘭等[16]通過對4株菌種在高氟環境下進行馴化，選育出了一株具有較高耐氟能力的菌種，運用16S rRNA基因克隆文庫技術分析表明：該菌與A.ferrivorans菌相似度達到99%，并且具有較強的抗氟性和嗜鐵性，A.ferrivorans菌將在含氟鈾礦石的生物浸出中發揮重要作用。

目前，國內外雖有對A.ferrivorans性能研究的相關報道，但多集中于該菌耐受機理的理論研究，而A.ferrivorans菌作為酸法地浸鈾礦山氧化劑的研究卻鮮有報道。試驗參照新疆某酸法地浸采鈾礦山吸附尾液溫度、pH以及生產工藝條件，初步研究了A.ferrivorans菌氧化Fe2+的特性，并在現場進行細菌的耐酸馴化，首次采用耐酸性強、比表面積大、直徑為3～5 mm的生物陶粒作為浸鈾細菌掛膜載體，對細菌進行固定化培養，提高單位體積的細菌數量，從而加快細菌連續氧化Fe2+速率，為A.ferrivorans菌代替中溫菌在低溫和高酸環境下作氧化劑提供依據。

1 試驗材料及儀器

A.ferrivorans和A.ferrooxidans均來自于南華大學鈾礦冶生物技術實驗室，9K培養基試劑和FeSO4·7H2O購自天津市科密歐化學試劑有限公司，吸附尾液取自新疆中核天山鈾業有限公司某廠水冶車間，耐酸生物陶粒購自滎陽綠錦活性炭有限公司，IS-RDD3臺式恒溫振蕩器購自美國精騏有限公司，有機玻璃生物反應器(圖1)為自制。

圖1 生物反應器

2 試驗方法

2.1 細菌氧化Fe2+的活性表征

A.ferrivorans和A.ferrooxidans在生長和繁殖過程中，作為電子傳遞鏈上的各種細胞色素都具有特定的氧化還原電位，隨著Fe3+濃度的升高，培養液的氧化性隨之增強，并且細菌以氧化Fe2+成Fe3+作為主要代謝途徑，即細菌氧化Fe2+的速率與細菌的生長速率存在正相關關系[17]。所以細菌的活性通過測定培養液的氧化還原電位以及Fe2+的氧化速率來表征。

2.2 分析方法

試驗用重鉻酸鉀滴定法測定培養液的Fe2+濃度，分析步驟及方法參見文獻[16]；用pH計(pHS-3C)測定培養液的pH、氧化還原電位(簡稱Eh)。

2.3 培養基成分與菌種活化

試驗所用9K培養基成分見表1，用2 mol/L硫酸溶液調節pH,另據條件試驗Fe2+濃度要求添加 FeSO4·7H2O。為保證菌種活性，每次條件試驗前，需對菌種進行活化培養。取2個250 mL錐形瓶，分別加入90 mL Fe2+濃度為1 g/L的9K培養基(pH=2.0)以及10 mL的A.ferrivorans或A.ferrooxidans(即按10%的體積分數接種)，測定初始Eh，置于恒溫振蕩器中，調節溫度為25 ℃、轉速為170 r/min，培養至Eh為500 mV左右即可作為接種菌種用于條件試驗。

表1 9K培養基成分

2.4 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

取6個250 mL錐形瓶，按5%、10%、20%、30%、40%、50%接種比例分別加入A.ferrivorans菌液7.5 mL、15 mL、30 mL、45 mL、60 mL、75 mL，再依次加入Fe2+濃度為1 g/L的9K培養基(pH=2.0)142.5 mL、135 mL、120 mL、105 mL、90 mL、75 mL。測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調節溫度為25 ℃、轉速為170 r/min，開始培養，每隔6 h測定Eh及Fe2+濃度，直至Fe2+氧化完全。

2.5 初始Fe2+濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

取3個250 mL錐形瓶，分別加入初始Fe2+濃度為0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L的9K培養基(pH=2.0)135 mL以及15 mL的A.ferrivorans菌液，測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調節溫度為25 ℃、轉速為170 r/min，開始培養，每隔6 h測定Eh及Fe2+濃度，直至Fe2+被全部氧化。

2.6 溫度對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

取2個250 mL錐形瓶，分別加入135 mL Fe2+濃度為1 g/L的培養基(pH=2.0)以及15 mLA.ferrivorans或A.ferrooxidans菌液。測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調節溫度為5 ℃、轉速為170 r/min，開始培養，每隔24 h測定Eh及Fe2+濃度，其他溫度條件(15、25 ℃)按相同方法依次進行。

2.7 A.ferrivorans的耐酸馴化

量取300 mL吸附尾液(成分見表2)至錐形瓶中，加入4.5 g濃硫酸和1.5 g FeSO4·7H2O，攪拌至溶解,再加入300 mL的A.ferrivorans菌液。測定初始Eh、pH，置于水浴恒溫振蕩器中，調節溫度為25 ℃、轉速為160 r/min，開始培養，每隔12 h測定Eh、pH。當培養液Eh達到550 mV左右時，量取此培養液300 mL作為接種菌液，按上述方法進行第二、三、四、五次耐酸馴化。

表2 吸附尾液成分

2.8 A.ferrivorans固定化培養

向裝有5 L生物陶粒的反應器中加入2 L Fe2+濃度為1 g/L、pH=2.0的9K培養基，再加入0.4 L的A.ferrivorans菌液，測定初始Eh，調節通氣量為 5 L/min，開始培養，每隔1 h測定培養液Eh和Fe2+濃度；待Fe2+氧化完成時，向反應器中加10 g FeSO4·7H2O，當Fe2+被完全氧化后，再補加1次 10 g FeSO4·7H2O；為驗證細菌固定化效果，在保證反應器中生物陶粒不發生位置移動的前提下，排盡反應器中培養液后，不添加菌液，只加2 L Fe2+濃度為1 g/L、 pH=2.0的9K培養基，測定初始Eh，再調節通氣量為5 L/min，培養至Fe2+全部氧化完成，按此方法重復8次。

細菌固定化完成后，取少量生物陶粒，加入濃度為4%的戊二醛固定處理，放入溫度為4 ℃的冰箱內保存，用于掃描電鏡分析。

2.9 固定化細菌與游離細菌氧化Fe2+速率的對比

細菌固定化培養結束后，放出反應器中的培養液，將此培養液均分成2份備用。放出反應器中的一半陶粒，再加入1份備用培養液，記為A培養液；另1份培養液加入未裝填生物陶粒的反應器中，記為B培養液，再向A、B培養液中分別加5 g FeSO4·7H2O，測定初始培養液的Eh，均在通氣量為5 L/min下培養，每隔1 h測定Eh和Fe2+濃度，進一步驗證細菌在生物陶粒上的固定化效果。

3 試驗結果與討論

3.1 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

細菌接種量直接影響培養液中的細菌基數，從而影響細菌的整體增殖速度和氧化Fe2+的速率。接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響見圖2。

從圖2(a)可知，培養液初始電位隨著細菌接種量的增加而增大，不同培養液中的細菌都在30 h左右開始進入對數生長期，表明接種量對細菌遲緩期的影響較小。從圖2(b)可知，接種量從5%提高至50%，Fe2+濃度下降的速率越來越快，表明培養液氧化Fe2+的速率加快，Fe2+的氧化時間縮短。從代謝產物對細菌活性的影響[18]以及生產成本考慮，A.ferrivorans的接種量以10%為宜。

3.2 Fe2+初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

對于A.ferrivorans來說，可利用Fe2+氧化成Fe3+過程中產生的能量來維持自身的生長繁殖。Kevin等[6]的研究表明，A.ferrivorans與A.ferrooxidans的DNA染色體的G+C只有4%不同，因此，A.ferrivorans可能類似于A.ferrooxidans，在產能過程中也需要Fe2+將電子傳遞給分子氧，傳遞過程中細胞質內有質子消耗，從而驅動ATP的合成來維持細菌的活性[19-20]。圖3為Fe2+初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響結果。

圖2 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

從圖3可知，氧化還原電位上升的幅度大致相當，且Fe2+的氧化速率也大致相當，這表明Fe2+的初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響較小，細菌完全可以在Fe2+含量為0.3～0.5 g/L的吸附尾液中較好地生長和繁殖。

圖3 不同初始Fe2+濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

3.3 溫度對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

溫度對A.ferrivorans與A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影響見圖4。

圖4 溫度對A.ferrivorans與A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影響

從圖4可知，溫度在5～25 ℃時，2種細菌氧化Fe2+速率都隨著溫度的升高而加快，A.ferrivorans尤為明顯，說明隨著溫度的升高，細菌的細胞質膜流動性隨之變大，這有利于營養物質進入胞內和代謝產物排出胞外，使細菌的生長繁殖加快，促使細菌氧化速率增加。在試驗溫度條件下，A.ferrivorans培養液中Eh上升的速度和Fe2+的氧化速率均高于A.ferrooxidans培養液。當溫度為5 ℃，可能是由于A.ferrooxidans的細胞膜呈晶格排列，營養物質的運輸受阻，酶促反應停止，導致細菌幾乎處于停止生長狀態，而A.ferrivorans能繼續生長并保持較好的氧化性，主要是因為該菌自身具有耐冷基因以及脂肪酸合成中的特有基因族利于在低溫環境中生長[21-22]，從文獻[14]也可以推測，A.ferrivorans特有的TCS功能涉及耐冷調控。A.ferrivorans與A.ferrooxidans在生長繁殖過程中所發生的一系列化學反應絕大多數都是在特定酶催化作用下完成的，每一種酶都有合適的酶促反應溫度，溫度的變化影響酶促反應率，進而影響菌體的活性，結合新疆酸法地浸鈾礦山所處的氣候條件，A.ferrivorans更適于用作浸鈾的目標菌種。

3.4 A.ferrivorans的耐酸馴化

在細菌生長和繁殖過程中，機體內發生的化學反應大多是酶促反應，而酶促反應必須在一定的pH范圍內進行，在此范圍內只要條件適合，酶促反應率達到最高，細菌生長活性最好，所以培養液的酸堿度是影響細菌生長活性的重要因素之一。細菌耐酸馴化試驗結果見圖5，圖中1～5代表馴化次數。

圖5 A.ferrivorans耐酸馴化試驗

從圖5(a)可知，A.ferrivorans第1次耐酸馴化時，細菌緩慢生長期較長，約為96 h；隨著馴化次數增加，緩慢生長期縮短，對數生長期提前，細菌耐受酸的能力明顯增強。表明A.ferrivorans在酸度較高的培養液中形成越來越完善的代謝調節機制，使細胞內復雜的生物化學反應能高度有序進行。從圖5(b)可知，當培養液pH=0.31時，A.ferrivorans仍能保持較好的生長活性和氧化性，這也表明，A.ferrivorans經耐酸馴化后，完全適應酸法地浸采鈾礦山吸附尾液環境。

3.5 A.ferrivorans固定化培養

在自然界中，細菌往往并不是以游離態存在和生長繁殖，而是會成群吸附到固體表面，共同分泌以多糖、蛋白質和DNA為主要成分的黏液到細胞外，形成多層有序的群體結構——能把自己包裹起來的生物膜。生物膜上分布有許多微小孔道，有利于營養物質進入膜內、代謝產物排出膜外，維持整個生物膜內細菌群體的生長和繁殖[23]。在適宜的生長環境下，A.ferrivorans菌也有形成生物膜的特點。

A.ferrivorans固定化培養試驗在室內進行，反應器內培養液溫度為19～20 ℃，試驗結果見圖6、圖7，圖6中的1～10代表固定化培養次數。

圖6 A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化培養

從圖6可知，對細菌進行第2次固定化培養時，Fe2+的氧化速率約為第1次的2倍，這是由于在第1次固定化培養后，在不更換培養基的情況下，直接補加2次FeSO4·7H2O進行靜態培養，在此期間，可能生物膜在陶粒表面已初步形成，從而加快了氧化速率。為驗證細菌是否形成生物膜，從第2次開始，只添加培養基未添加菌液，隨著培養液更換次數的增加，反應器內細菌氧化等量Fe2+的速率也逐步增大，至第8次開始穩定在3 h左右。表明陶粒表面生物膜逐漸生成，膜內細菌的生長和繁殖隨之加快，并且從第8次起，細菌在生物膜內生長和繁殖開始趨于穩定，氧化Fe2+的速率穩定在0.33 g/(Lh)左右。

圖7 生物陶粒表面掛膜前后SEM圖像

從圖7(a)可知，生物陶粒表面比較粗糙，分布著不規則的紋理狀結構和發育良好的孔隙，這為A.ferrivorans的附著提供了充足的場所，對比圖7(a)，從圖7(b)可以看出，生物陶粒表面形成了較厚且不均勻的生物膜，生物膜上可見利于細菌代謝產物排出和營養物質進入的微孔[24-25]，這些微孔也為細菌進出生物膜提供了通道。

3.6 固定化細菌與游離態細菌氧化Fe2+活性對比

通過固定化細菌與游離態細菌氧化速率對比試驗，進一步驗證A.ferrivorans生物膜形成后氧化Fe2+的效果，結果見圖8。

從圖8可知，A培養液中Eh上升的速度和細菌氧化速率明顯高于B培養液,表明固定化細菌和游離態細菌協同氧化Fe2+的速率高于游離態細菌單獨氧化的速率，即A.ferrivorans在生物陶粒上進行固定化培養有利于加快Fe2+的氧化速率，有助于解決以往細菌浸鈾過程中Fe2+氧化速率較慢的問題。

4 結 論

(1)接種量對A.ferrivorans的緩慢生長期影響較小，考慮時間和經濟成本，A.ferrivorans的接種量宜為10%左右；Fe2+的初始濃度為0.3～0.5 g/L時，對細菌的生長活性影響較小，表明吸附尾液中Fe2+含量為0.3～0.5 g/L能滿足A.ferrivorans較快生長繁殖。

圖8 A.ferrivorans固定化培養后氧化Fe2+速率對比試驗

(2)溫度為5～25 ℃時，A.ferrooxidans的最大氧化速率為0.018 g/(Lh)，A.ferrivorans為0.024 g/(Lh)，與A.ferrooxidans相比，A.ferrivorans更適應新疆酸法地浸鈾礦山尾液的低溫環境。

(3)A.ferrivorans經多次耐酸馴化，細菌能在高酸(pH=0.31)培養液中保持較好的生長活性，滿足現場生產工藝要求。

(4)A.ferrivorans經過多次固定化培養，陶粒表面生物膜逐漸生成，氧化Fe2+速率持續加快，最大氧化速率達到0.33 g/(Lh)，固定化細菌和游離態細菌協同氧化等量Fe2+的速率是游離態細菌單獨氧化的3.4倍，A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化，大幅提高了氧化Fe2+的速率。

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