ctDNA應用于非小細胞肺癌的研究進展*

曾 力 綜述，吳永忠，翁克貴 審校

(重慶大學附屬腫瘤醫院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫院 400030)

目前，肺癌的主要治療手段包括手術、靶向治療、免疫治療、化療、放療等[1]，在治療前通常需要有明確的組織學或細胞學診斷才能更好地實現精準治療。近年來，隨著腫瘤分子生物學研究的快速發展，新一代“液體活檢”成為目前關注的焦點，其中檢測血液中的ctDNA在腫瘤的診斷、治療及預后評估監測等方面開始發揮重要作用[2]。其標本采用外周血，具有微創、方便、經濟、快速、可重復性高等優勢，適合臨床應用。

1ctDNA的生物學特征

循環游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)是血液的組成部分之一，可以從血漿中分離出來[3]。cfDNA不僅可在惡性腫瘤的患者外周血中檢測到，同時也可以在健康人、非惡性疾病患者中發現，如紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、肺栓塞、侵入性治療措施、孕婦等[4]，ctDNA是由腫瘤細胞壞死、凋亡后分泌釋放的一種游離DNA，其基因組信息與腫瘤組織一致，代表來自原發性腫瘤和轉移灶的組合遺傳物質，其片段的大小約為166 bp[5]。當癌細胞大量播散和壞死時，釋放出來的核酸超過機體的清除力，所以惡性腫瘤患者體內cfDNA的含量高于健康人。有研究表明，健康人體內的cfDNA含量非常少，1～100 μg/L，平均約30 μg/L。而腫瘤患者體內的cfDNA含量可達到1 000 μg /L，平均約180 μg/L。除此以外，外傷、鍛煉、心肌梗死、終末期腎衰等也會使血液中cfDNA含量增加[4,6-8]。

2ctDNA的檢測

一般認為，ctDNA與健康人cfDNA的區別就在于ctDNA有體細胞基因突變，而這些突變僅存在于癌前細胞或者癌細胞基因組中，在同一機體內，它不會出現在其他正常細胞的DNA，因此用于檢測體細胞變異體DNA的方法也能用于ctDNA的檢測[6]。隨著DNA 測序技術的快速發展，通過現有檢測手段如突變擴增阻滯系統(ARMS)、數字PCR(dPCR)、新一代測序(NGS)等可以實現對ctDNA進行直接定性定量分析，通過DNA擴增對ctDNA進行精確檢測[3]。ARMS、dPCR靈敏度高，據研究顯示，其檢測ctDNA部分突變基因與通過組織活檢發現的突變基因相一致，而NGS可以對多基因核酸片段進行高通量平行深度測序，檢測出極其罕見的突變基因，但該技術卻不能直接檢測天然DNA中的堿基修飾[9-11]。目前尚在研發中的一種新興測序技術，即因態納米孔測序技術，又被稱為第四代DNA測序技術，該技術借助純物理學方法，不需要利用光信號及生化預處理材料，而是利用不同的堿基通過納米孔時產生的電信號變化直接進行測序，具有高讀長、易集成、省時間等優勢[12-13]。

3 檢測ctDNA的優勢

目前，腫瘤組織活檢是臨床研究測序的主要方法，但腫瘤組織的獲取過程為有創性操作，部分患者在操作后可能出現嚴重并發癥，患者接受度低，此外，獲得的組織標本是通過福爾馬林固定石蠟包埋的方式進行保存，可能出現DNA被降解的情況。另外，由于腫瘤的異質性，即便是在同一個體中，其體內轉移灶與原發灶的腫瘤細胞共有的突變可能僅占三分之一[14]。由此可見，組織活檢用于診斷腫瘤不僅不能達到百分之百的準確率，還有可能對機體造成損傷。而檢測血液中的ctDNA即“液體活檢”，比組織活檢更快，更容易重復，可以獲取關于癌癥的實時信息，指導臨床治療方案的選擇，它提供的信息更全面，具有經濟、快捷、方便、微創等特點，更能實現對腫瘤進展的實時跟蹤。組織活檢獲得的癌癥信息是靜態的，而液體活檢技術更能及時、有效的反映治療過程中腫瘤的動態變化情況。采用外周血作為標本，操作容易實現，可重復多次采血，從而實時監測治療反應的動態變化[7,15]。

4ctDNA在非小細胞肺癌中的應用

鑒于臨床病理特征在非小細胞肺癌中應用的局限及腫瘤固有分子生物學特征的巨大差異，從分子生物學角度尋找用于非小細胞肺癌耐藥監測、預后評估、微小殘留灶追蹤、復發監測等的新生生物學指標成為了目前關注的焦點[16]。盡管液體活檢應用于臨床還未獲得批準，但相關研究已顯示出其巨大的應用價值。

4.1靶向藥物用藥指導及耐藥監測 單個基因改變可指導臨床靶向治療，如結腸腫瘤患者存在KRAS基因突變將對EGFR-TKI產生耐藥[17]，非小細胞肺癌患者有ALK 重排會對克里唑替尼產生耐藥[18]，黑色素瘤患者存在BRAF突變可能對維羅非尼產生耐藥[19]。研究顯示，高水平KRAS基因突變對結直腸腫瘤患者進行西妥昔單抗、伊立替康治療起到很好的指示作用[20]。

根據NCCN指南推薦，靶向治療是目前非小細胞肺癌治療方案的首選，但很多患者在服藥過程中相繼出現耐藥。近年來，大量研究表明液體活檢可以有效地監測到治療過程中出現的耐藥基因，如EGFR-T790M，攜帶有該基因的患者超過半數會對靶向藥物產生繼發性耐藥[21]。利用ctDNA 檢測技術，有學者[22]對接受EGFR抑制劑類藥物治療的癌癥患者進行耐藥性靶點的檢測發現，KRAS基因出現了40余種與耐藥相關的基因突變。ZHENG等[23]對318例進行EGFR-TKI靶向治療的非小細胞肺癌患者進行觀察，通過檢測ctDNA發現約36%(117例)患者存在耐藥，約47%(55例)患者發生T790M突變。

4.2預后評估 預后評估主要根據影像學資料、參考其他輔助檢查，再結合臨床表現、疾病分期、組織病理學及分子生物學特征等因素進行綜合判斷，而這些信息多從影像資料及活檢標本中得到。影像學檢查價格昂貴、對人體有輻射；組織切片通常不易獲得且為有創檢查，患者接受度相對較低。而“液體活檢”用于預后評估，微創、方便、經濟、快速，進行DNA分析是監測腫瘤基因組實時變化的一種有效手段，是對組織活檢分子領域的重要補充[15]。

在一項對246例接受一線靶向治療的晚期非小細胞肺癌患者進行多變量分析中發現，檢測到KRAS突變的患者預后相對較差[24]。有研究顯示，ctDNA也可用于乳腺癌的預后評估，它采用的方法是全基因組測序，選取了30例攜帶有Tp53基因、PIK3CA基因突變的患者進行觀察并監測其治療過程中ctDNA的動態變化,他們發現，該變化與術后效果一致，療效越好，ctDNA含量越低[14]。另一項在胰腺癌中的研究發現，存在KRAS基因突變與不存在KRAS基因突變的患者相比生存率更低，半年生存率比為17%∶41%，1年生存率比為0%∶24%[25]。

4.3追蹤微小殘留病灶 ctDNA可用于探測經手術或藥物治療后疾病的復發。目前監測疾病復發的主要手段是放射影像學檢查，其價格昂貴對人體有輻射，對于微小轉移灶不易檢測出。HABER等[9]在監測結直腸腫瘤患者術后血液中腫瘤的特定基因如APC、TP53、KRAS的研究中發現，ctDNA預測復發的靈敏度和特異度接近100%。另一項研究對55例乳腺癌早期患者經手術、化療等治療后血液中ctDNA 的變化進行監測發現，治療后血液中ctDNA陽性患者較ctDNA陰性患者復發率高，可達12倍左右，而且在復發前8個月已經可以在血液中檢測到ctDNA[26]。此外，在慢性淋巴細胞白血病的治療中，檢測ctDNA對微小殘留病進行評估，可以大致預測無進展生存期和總生存率[27]。

4.4評估腫瘤負荷，實時監測治療反應及腫瘤演變 MURTAZA等[28]研究指出，ctDNA可用于追蹤腫瘤負荷，監測癌癥基因組，在這項研究中，他們追蹤了1例3年內接受兩線靶向治療(他莫昔芬和曲妥珠單抗)的ER、HER2均為陽性的轉移性乳腺癌患者，應用深度擴增子測序的方法分析了8例腫瘤活檢標本和9例血漿標本，結果表明，血漿標本中的突變水平反映了由腫瘤活組織檢查測序所推斷的克隆層級，此外，在治療期間，體細胞突變的連續變化與腫瘤疾病進展、轉移部位之間的不同治療反應均有相關性，這些結果來自單個轉移性乳腺癌患者，表明ctDNA反映了克隆性腫瘤分級，并實時捕獲亞克隆的動態變化。

4.5觀察疾病治療抗性及復發 FIALA等[29]研究隊列由被診斷患有早期非小細胞肺癌的100例患者組成，并進行手術切除腫瘤，使用手術切除的腫瘤標本與健康組織來進行基因蛋白質編碼區域測序，隨后比較二者的序列，鑒定遺傳差異，特別是單核苷酸變體(SNV)，每人測試10～32個SNV，結果發現，SNV在腫瘤發展早期發現，與腫瘤異質性無關，在腫瘤前平均70 d從ctDNA測試結果中就可以觀察到治療抗性及復發，且ctDNA SNV突變頻率與腫瘤大小相關。

5 小 結

盡管ctDNA作為一種應用前景廣闊的無創性“液體活檢”手段，對癌癥特異性分子改變的研究有著重大潛力，但仍處于起步階段，要真正應用于臨床仍需克服諸多困難。(1)檢測靈敏度，目前沒有足夠的靈敏度來對無癥狀個體的肺癌進行檢測；(2)成本和時間，從單個基因組區域測序到創建特定的腫瘤特征，再進行“液體活檢”測試，最后由專業人士對大量數據進行分析，過程費用昂貴，等待時間較長；(3)即使檢測出ctDNA，也不能區分它是來源于原發灶還是轉移灶，其代表轉移異質性的程度未知；(4)即使檢測到腫瘤基因出現耐藥突變或者出現了新的突變基因，但如果沒有研究出相應藥物，依然束手無策。因此，ctDNA廣泛應用于臨床除了需要檢測流程的標準化外，還需要大量相關臨床試驗的進一步驗證。