草魚腸道拮抗性芽孢桿菌的凍干保護劑優化研究

張 濤，閆有利

(遼寧省淡水水產科學研究院，遼寧 遼陽 111000)

目前，隨著我國淡水漁業的發展，高密度集成養殖成為我國淡水漁業養殖的主要發展趨勢，而伴隨的水產養殖動物疾病頻發，死亡率增大等突出問題，也是水產工作者面臨亟需解決的問題。現在常用的廣譜抗菌類藥物由于耐藥性[1-6]，藥物殘留導致的環境污染等副作用嚴重影響了淡水養殖產業的健康發展，所以如何尋找一條既可以提高水產養殖動物免疫能力，降低水產動物發病率和死亡率，又可以降低藥物在長期使用后的不良副作用的途徑勢在必行。

芽孢桿菌(Bacillus)是一種好氧微生物，不僅能夠改善水質[7-12]，而且能在腸道中產生生物工程利用價值極高的脂肽類和肽類抗生素，同時能產生多種消化酶[13-14]，提高水產養殖動物的免疫能力[15-16]，并抑制有害細菌的繁殖，促進水產養殖動物的健康成長[17]。研究表明，飼料中添加芽孢桿菌能有效改變魚蝦腸道內的細菌種群，從而能顯著提高水產養殖動物的非特異性免疫指標和消化酶活性，促進水產動物健康生長[18-24]。

已有的試驗表明，在草魚(Ctenopharyngodonidellus)腸道內篩選出抑菌活性很強的芽孢桿菌，并以一定含量攪拌到草魚的飼料中，能提高草魚的生長率，降低草魚的發病率和死亡率。而如何較好的保存由草魚腸道提取的病原拮抗性芽孢桿菌的活性和穩定性的報道較少。由脫脂乳、海藻糖、甘油、谷氨酸4種組分組成的混合保護劑可在冷凍干燥中對日本金龜子芽孢桿菌(B.popilliae)的孢子提供最有效的支持和保護,其最佳組合為10%脫脂乳，8%海藻糖，2%甘油，0.2%谷氨酸，在凍干過程中孢子的活性保持率達到90%以上[25]。筆者通過冷凍干燥方法，設計不同保護劑配方的正交試驗，從而篩選出對草魚拮抗性芽孢桿菌保存較好的試驗配方，為后期草魚養殖過程中的病害防治和制劑學研究提供一定的科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚健康無病，采自于遼寧省淡水水產科學研究院試驗基地。麥芽糊精、海藻糖和甘氨酸來源、性狀等見表1。

表1 試驗藥物性狀

1.2 方法

1.2.1 病原拮抗性芽孢桿菌的處理

采用80 ℃水浴法[26]從草魚腸道內分離并純化芽孢桿菌，再通過牛津杯法[27]篩選出病原拮抗性芽孢桿菌。將實驗室制得的病原拮抗性芽孢桿菌接種到裝有滅過菌的普通液體培養基的三角瓶中，并在37 ℃恒溫搖床中培養48 h；培養后的菌懸液放入滅菌過的50 mL離心管中，并在4 ℃、6000 r/min的冷凍離心機中離心6 min后，倒出上清液，留有的沉淀既是擴增后的菌體；在沉淀中加入滅菌生理鹽水洗滌細胞，去除上清液；再加入滅菌的15 mL的不同保護劑溶液(表2～3)，混勻后加入10 mL西林瓶中，每個西林瓶加入5 mL菌懸液，共3個平行組；放入-80 ℃冰箱24 h后，移至FD5505冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，以凍干后菌體存活率為評價指標，優選病原拮抗性芽孢桿菌凍干保護劑配方，并以對照組為參照。

凍干條件：將每個裝有5 mL菌懸液的西林瓶從-80 ℃冰箱拿出后，放至FD5505冷凍干燥機中，經過預凍后的菌懸液分別進行冷凝干燥和解析干燥；第一步冷凝干燥時，將冷凍干燥箱的前箱隔板溫度設置為-35 ℃，后箱冷阱溫度設置為-80 ℃，時間設置為25 h，壓力設置為10 Pa；第二步解析干燥時，將冷凍干燥箱的前箱隔板溫度設置為20 ℃，后箱冷阱溫度設置為-80 ℃，時間設置為23 h，壓力設置為10 Pa。冷凝干燥和解析干燥結束后，對每個西林瓶進行手動壓蓋，即制成菌體凍干品。

凍干后菌體成活率：凍干后的菌體用5 mL蒸餾水加入10 mL西林瓶中復溶，并采用平板菌落計數法[28]，分別記錄菌體凍干前后的菌體數，并通過1.3中的公式計算凍干后菌體成活率。

設置麥芽糊精、甘氨酸和海藻糖3個變量因素，采用三因素三水平(表2)，即L9(34)正交試驗法優選病原拮抗性芽孢桿菌凍干保護劑最佳配比含量，每組試驗設定3個平行組。

表2 因素水平表

1.2.2 菌體穩定性試驗

根據上述正交試驗測試結果，篩選出菌體成活率較高的兩組凍干保護劑配方，分別將實驗室制得的菌體加入篩選出的凍干保護劑后(方法同1.2.1)，經過冷凍干燥放在4 ℃冰箱中保存，在分別測試1、3、5、7、9、12個月后的菌體成活率，每組3個平行(表5～6)。菌體成活率測試方法與1.2.1相同。

1.3 數據的統計和分析

記錄凍干后菌體成活率，試驗數據用平均值±標準差表示，采用SPSS 15.0在α=0.05水平下進行統計分析，數據經方差分析后進行組間兩兩比較和顯著性檢驗(P<0.05)，并采用層次分析法統計正交試驗結果[29]。

式中，S為菌體成活率，S1為菌體凍干前菌群數量(cfu/mL)，S2為菌體凍干后菌群數量(cfu/mL)。

2 結果與分析

以凍干后菌體存活率為考察指標時，極差R值大小顯示各因素對菌體存活率作用影響為A>B>C(表3)。其中，B、C因素R值<空列組R值，說明A因素對凍干后菌體存活率作用最重要；其中，A1B3C3的凍干保護劑配方對菌體存活率高達(93.30±2.21)%，高于A1B1C1和A2B1C2的凍干保護劑配方對菌體存活率，但不顯著(P>0.05)，顯著高于其他凍干保護劑配方對菌體的存活率(P<0.05)。

表3 菌體凍干保存試驗測定結果

注：同列中標有不同字母的平均值之間有顯著性差異(P<0.05).

方差分析表明各因素無顯著差異(P>0.05)(表4)。從正交試驗(表3)和方差分析(表4)綜合結果可知，以凍干后菌體存活率為考察指標時，菌體凍干保護劑最佳配方為A1B1C3。由正交試驗(表3)和方差分析(表4)綜合結果中，篩選出2種凍干保護劑配方(表5)。

表4 菌體凍干后成活率方差分析結果

表5 菌體凍干保存劑的篩選配方

在經過12個月的穩定性試驗(表6)可知，A1B1C3的凍干保護劑配方對菌體存活率高于A1B3C3的凍干保護劑配方對菌體存活率，但不顯著(P>0.05)。

綜合上述正交試驗和穩定性試驗結果分析，A1B1C3的凍干保護劑配方可以有效的保護菌體的成活；在經過12個月后，仍然可以使菌體達到80%以上的存活率，基本達到了益生菌經過長期保存而不失活的目的。

表6 菌體凍干后穩定性試驗

注：同列中標有不同字母的平均值之間有顯著性差異(P<0.05).

3 討 論

目前，我國關于芽孢桿菌在淡水漁業養殖上的應用報道較多[30-33]。這些報道表明，芽孢桿菌不僅具有改善水質的能力，而且能夠有效改變水產養殖動物的腸道細菌種群，抑制有害細菌的產生，從而提高了水生動物的防病能力；而如何能在水產養殖應用過程中保存其生物活性和穩定性是芽孢桿菌提取和保存工藝的重要一環。

本試驗采用冷凍干燥的方法保存病原拮抗性芽孢桿菌，與其他方法比較，主要有以下幾方面優勢：(1)芽孢桿菌屬于原核細胞型微生物，對溫度比較敏感，在高溫條件下易繁殖、老化和死亡；而在低溫干燥條件下，芽孢桿菌其生物活性損失較少。(2)芽孢桿菌屬于好氧微生物，在真空干燥條件下，環境的氧氣極少，芽孢桿菌處于休眠狀態，不易繁殖，其生物活性可以得到有效保護。(3)冷凍干燥法可以去除菌懸液95%～99%的水分，并保持芽孢桿菌生物活性的穩定性，從而便于其運輸和長期保存。

微生物凍干燥過程中賦形劑的選擇是決定冷凍干燥能否成功的關鍵因素。目前，根據化學性質，微生物凍干賦形劑有單糖(葡頭糖、半乳糖等)、二糖(乳糖、海藻糖等)和多糖類(糊精、淀粉等)，多元醇類保護劑(甘油、甘露醇等)、氨基酸類保護劑(甘氨酸、色氨酸等)、蛋白質和多肽類保護劑(生長因子、激素等)以及聚合物類保護劑(牛血清白蛋白、麥芽糊精等)[34]。

為防止凍干過程中芽孢桿菌生物活性的損失，本試驗選取了海藻糖、麥芽糊精和甘氨酸作為芽孢桿菌的凍干賦形劑，其主要依據以下幾方面因素[35]：(1)與單糖、多糖和還原性二糖比較，海藻糖屬于非還原二糖，不存在與凍干品發生還原性Mailard反應；同時，海藻糖作為二糖能在凍結過程中更好的起到低溫保護劑的作用，并在干燥脫水過程中起到脫水保護劑的作用。(2)與多元醇類、多肽類及其他聚合物賦形劑比較，麥芽糊精作為一種聚合物賦形劑成本較低，在冷凍干燥過程中，其優先析出，具有一定的表面活性，并在細菌分子之間產生“位阻”作用，從而減少芽孢桿菌的生物活性損失；同時，麥芽糊精能更好的提高菌懸液水溶液黏度，提高玻璃化轉變溫度，抑制小分子賦形劑海藻糖的結晶和pH值的降低；在微生物冷凍干燥過程中，麥芽糊精在凍結過程和脫水過程中都能提供更好的有效保護作用。(3)筆者在前期試驗篩選氨基酸類凍干賦形劑發現，芽孢桿菌在快速凍結過程中，甘氨酸作為氨基酸類凍干賦形劑，能夠更有效的抑制菌懸液的pH值變化，減少了芽孢桿菌生物活性的損失。(4)聚合物凍干保護劑一般不單獨使用，當麥芽糊精作為一種聚合物保護劑與糖類或氨基酸類物質聯合使用時，可以與蛋白質物質形成很強的氫鍵作用，更好的保證了凍干微生物的穩定性。

綜合上述試驗結果和幾方面因素分析，芽孢桿菌的生物活性總體趨勢與時間有一定關系，時間越長，生物活性越低，說明這3種賦形劑對微生物細菌凍干粉活性影響隨著時間的增長會逐漸降低，從而影響到芽孢桿菌生物活性穩定性。3種賦形劑對芽孢桿菌生物活性影響依次為麥芽糊精>甘氨酸>海藻糖，各賦形劑差異雖不顯著(P>0.05)，但海藻糖、甘氨酸并不是起主要作用的賦形劑，這說明聚合物類的賦形劑保護功能強于低聚糖及氨基酸類賦形劑。上述3種賦形劑的正交試驗結果表明，當以凍干后菌體成活率為評價指標時，3種賦形劑最佳配方為A1B1C3。

通過試驗篩選出的病原拮抗性芽孢桿菌保存配方A1B1C3，即2%麥芽糊精，0.5%甘氨酸，6%海藻糖，經過12個月保存后，其生物活性仍然超過80%，為后期草魚養殖過程中的病害防治，減少魚體發病和死亡率起到了保駕護航的作用。

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