顯微注射法利用胚胎干細胞制備嵌合鼠的研究

馬玉娥

（蘇州大學劍橋-蘇大基因資源中心，江蘇蘇州215123）

在當今生物醫學研究中，嵌合體制備技術發揮著非常重要的作用，已被廣泛應用于遺傳學、胚胎學、毒理學、發育生物學、細胞生物學和醫學等眾多研究領域[1-3]。將經基因修飾的胚胎干（ES）細胞導入小鼠植入前胚胎制備的生殖系傳遞的嵌合個體，已成為基因功能和致病機理等方面研究的重要模式。所謂嵌合體是指由兩種或兩種以上具有全能性和多能性的細胞系發育而成的復合體。目前，制備嵌合體主要有顯微注射法、聚集法和共培養法三種。

顯微注射法是通過使用顯微操作儀將ES細胞注入胚胎中制備嵌合體。聚集法是較受歡迎的制備嵌合體的方法，僅次于顯微注射法，它是將去除透明帶的4-細胞期或8-細胞期胚胎或桑葚胚與ES細胞置于聚集培養液中進行聚集，該方法不需要昂貴精密的儀器，操作簡單、效率高，但成功率低。由于需要較多的胚胎進行操作，而近交系小鼠因其產卵量少不適合此方法。另外，因其無法對ES細胞進行質量篩選，導致在體外培養和操作時間長，易受理化因素的影響。共培養法是將ES細胞同去除透明帶8-細胞時期胚胎培養，該方法可同時對大量胚胎進行操作，技術簡單，不需要貴重的儀器，但成功率低，當前研究中很少使用該方法。本文結合最常用的方法—顯微注射法及其制備嵌合體影響因素的最新進展進行綜述。

1 顯微注射法

顯微注射法制備嵌合體最早由Gardner于1968年創建，其通過囊胚腔注射法成功獲得嵌合體[4]。1984年Bradley等[5]首次成功獲得生殖系傳遞的嵌合小鼠，使用的也是囊胚腔注射法，此后該方法才逐漸發展成熟，并得以廣泛應用。所謂顯微注射法是指通過顯微注射儀將挑選好的一定數目的ES細胞注入胚胎中，一般采用囊胚注射，也有實驗室采用8-細胞注射，即選用的是不同發育階段的胚胎。但囊胚注射被認為是獲得嵌合體的最常用和最經典的方法。其優點是可在顯微鏡下挑選光滑、圓形的形態質量好的細胞，受到體外各種因素的影響也會因胚胎和干細胞在體外暴露的時間短而明顯減少。另外，該方法穩定、重復性強、成功率高，但也存在一定的缺點：需要昂貴的儀器設備和熟練的操作技能，效率低，平均每小時只能注射20～40枚囊胚，一天注射的胚胎數量極限為100個。8-細胞注射主要是將ES細胞注入8細胞期胚胎的卵裂球間隙。該方法可以獲得較多的嵌合鼠，這是由于8細胞晚期胚胎的分裂球開始致密化，分裂球間建立了各種連接，此時引入ES細胞，很容易與宿主細胞之間建立聯系。但該方法中注射針易傷及卵裂球，造成胚胎的損傷，不利于嵌合胚的生長發育。近年來，壓電微操作系統（Piezo）的應用，成功地解決了注射針損傷胚胎的難題，極大地提高了注射成功率和注射效率。有研究表明，與傳統的注射方法相比，通過應用Piezo設備，可以提高嵌合體小鼠的出生率和雄性嵌合鼠數目，而且對胚胎無傷害[6]。但該方法因需要額外投入昂貴的儀器以及對操作技能的更高要求而未得到廣泛的應用。目前，使用傳統的顯微注射法將來源于C57BL/6品系的ES細胞注入遠交或近交白化鼠囊胚已成為一種標準的注射方法。

2 嵌合體制備影響因素

顯微注射法制備嵌合體小鼠除受操作技巧熟練程度的影響，還受ES細胞的影響，包括ES細胞特性、質量、背景及注射時挑選的ES細胞數目。

2.1 ES細胞的特性

1981年，Evans等[7]首次報道了從正常小鼠胚胎中分離建立了胚胎多能干細胞系，簡稱ES細胞。該細胞具有在體外無限增殖能力和多方向分化潛能以及種系嵌合能力的特性，而ES細胞的全能性保持是制備嵌合體的先決條件。維持ES細胞增殖同時抑制其分化傾向，其分化全能性才得以保持，否則意味著嵌合體制備的失敗。

ES細胞對培養條件要求非常嚴格，不僅需要優質的培養液來提供必需的營養成分和能源物質，還需要足夠的分化抑制因子，如白血病抑制因子（LIF），維持其未分化狀態[1]。研究表明，小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）上清液培養體系不僅能長期有效維持小鼠胚胎干細胞的增殖，并且能夠有效地抑制其分化[8]。Ramire等[9]發現注射前2h更換新鮮ES細胞培養液可提高制備嵌合鼠的效率，這是由于通過該操作，細胞的活性得到增加。

2.2 ES細胞的數目和質量

前期研究數據表明，引入早期胚胎的ES細胞數目會影響嵌合體的制備。細胞數目過少會使獲得的嵌合體的嵌合率很低；過多則會使早期胚胎生長發育異常，易在孕中期被吸收。要保證出生的小鼠有較高的嵌合率和正常發育率，Robert等[10]發現注射的ES細胞數目一般為5～10個或10～15個。有研究表明注入多個ES細胞可提高其與宿主囊胚細胞的競爭力，推測其原因：一是多個ES細胞相互間可通過分泌未知因子來維持其存活和發育能力，二是多個細胞增加了整合到ICM的概率[11]。通常情況下，為得到較高的嵌合效率，注入囊胚的ES細胞數目控制在10～15個。

除引入早期胚胎的ES細胞數目外，其質量也會影響嵌合體制備成功率。ES細胞的質量受培養環境和傳代次數影響。培養環境不良會使ES細胞核型不穩定，易發生基因外改變等異常現象。異常的ES細胞無法通過形態被確認，且不具備正常的發育能力，導入后會使ES細胞數目難以與嵌合體發育形成準確的對應關系[2]。另外，ES細胞的傳代次數越高，核型越不穩定，易發生遺傳性變異，從而導致小鼠遺傳背景的不穩定，降低了嵌合體小鼠制備的成功率。因此，在實驗中一般選擇傳代次數低的細胞[3]。但傳代次數過低會易導致雜細胞較多，增加挑選細胞的難度，降低注射效率。

2.3 ES細胞和宿主囊胚的遺傳背景

在嵌合體鼠的制作過程，供體和受體鼠的遺傳背景不匹配同樣會影響嵌合體制備的成功率。目前，有關供體鼠和受體鼠組合的研究報道很多，通常可對出生后的嵌合個體進行初步判斷，依據是細胞來源小鼠品系和供體鼠之間存在的毛色差異。129品系ES細胞由于穩定和易于種系嵌合等因素常被用來做基因修飾性小鼠模型，但129背景的鼠繁殖力差，免疫和行為方面容易異常，并且在獲得打靶動物后還需要回交到C57BL/6品系，比較耗時耗力[12-13]。而C57BL/6品系卻不存在這些不足，且不需要回交到C57BL/6，不僅節省了時間，還避免因背景不純引起的不穩定結果。另外，該品系已經用來進行小鼠全基因測序，遺傳背景信息豐富且清楚。因此，目前C57BL/6背景的ES細胞被認為是用于同源重組的最佳選擇。

隨著國際敲出小鼠聯盟（IKMC）使用C57BL/6N品系的ES細胞制作嵌合鼠的影響力不斷擴大，目前越來越多的研究致力于利用C57BL/6N品系的ES細胞和不同品系的受體鼠胚組合來提高生殖嵌合力。Thomas等[14]選用C57BL/6N和C57BL/6J的小鼠品系作為供體胚，注入C57BL/6N來源的ES細胞，發現C57BL/6J鼠胚的生殖嵌合率顯著高于C57BL/6N。Tuija等[15]通過分別向BALB/c和Tyr鼠胚中注入C57BL/6N ES細胞并進行比較分析，發現雖然Tyr鼠在囊胚獲取量上存在優勢，但BALB/c鼠在小鼠出生率、嵌合率、雄性嵌合率、生殖嵌合率方面均高于Tyr鼠，表明BALB/c鼠胚較適合C57BL/6N ES細胞注射。

此外，需要注意的是，顯微注射過程中，要挑選小的，光滑的，圓形的ES細胞。細胞不能過小，否則會吸入較多的培養液，注射到囊胚腔后會稀釋其中的重要因子；過大會被擠壓，導致變形，影響細胞質量，通常以注射針的直徑大小為宜。注射針中吸取的ES細胞數目不要太多，否則細胞易擠壓變形，易發生黏針、堵針，增加操作的難度，而且細胞的質量和數目會受到影響。另外，移植體品系的選擇，移植等技術環節都會影響嵌合體的成功制備。

3 結語

嵌合體制備技術不僅在生物醫學研究中發揮著巨大的作用，如研究基因功能、探究人類疾病機理、研究細胞分化機制等，而且在畜牧生產上有著廣泛的應用前景：培育動物新品種（高產，優質，抗病等），而利用四倍體胚胎補償技術（即以四倍體囊胚為宿主獲得的嵌合體）和其他技術結合可以達到優良性狀或瀕危動物遺傳資源保種目的。但如何高效獲取嵌合體的問題仍需要去研究和解決，本文闡述了嵌合體制備的最常用方法-顯微注射法以及嵌合體制備的影響因素，對高效獲取嵌合體具有一定的指導意義。