云南地區漢族人群CYP2C9 和 VKORC1 基因多態性研究*

趙曉麗,史瓊華,黃宏偉,錢 凈,邵劍春,黎海生,楊悅林，陳 俊,胡大春

(云南省昆明市第一人民醫院/昆明醫科大學附屬甘美醫院檢驗科 650011)

華法林是一種香豆素類口服抗凝藥，是目前治療血栓栓塞性疾病的一線抗凝藥物，近幾年的研究發現華法林的劑量需求受兩方面因素影響：(1)非遺傳因素，包括年齡、身高、體質量、疾病狀態、合并用藥等；(2)遺傳因素，包括與華法林藥代動力學和藥效學相關的基因多態性。而細胞色素 P450(CYP)2C9 基因(Cytochrome P450 2C9，CYP2C9)和維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1基因(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VKORC1)是造成個體間華法林維持劑量差異的主要遺傳因素，且這兩種基因存在明顯的種族差異[1]。本研究分析CYP2C9和VKORC1基因單核苷酸多態性在云南漢族人群中的頻率分布，為實現華法林個體化用藥劑量提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1-12月在本院就診患者和體檢樣本共202例，男105例，女97例，年齡18～85歲。所有志愿者均需簽署知情同意書后方可采樣。納入標準：年齡大于或等于18 歲，云南漢族，相互之間三代無血緣關系。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑 血液基因組 DNA 提取試劑盒，華法 林 敏 感 性 基 因 檢 測 試 劑 盒(華法林PCR反應液A,華法林PCR反應液B,華法林敏感性基因質控品，空白對照，華法林雜交液Ⅰ,雜交液Ⅱ,雜交液Ⅲ,華法林電化學傳感器)由中山大學達安基因股份有限公司提供。 臺式高速低溫離心機(Heraeus公司)，ABI PCR擴增儀，電化學基因傳感器檢測系統(中山大學達安基因股份有限公司)。

1.2.2基因組DNA的提取 選用EDTA-K2抗凝采血真空管采集外周靜脈血2～3 mL，-80 ℃保存，使用血液基因組 DNA 提取試劑盒快速提取基因組DNA。

1.2.3PCR反應 采用華法林敏感性基因檢測試劑盒,每個反應體系總體積40 μL,華法林PCR反應液A 37 μL,華法林PCR反應液B 3 μL和樣本核酸10 μL。 擴增條件:50 ℃ 3 min,94 ℃預變性15 min,94 ℃變性30 s,59 ℃退火35 s,72 ℃延伸40 s,45個循環,最后72 ℃再延伸7 min。

1.2.4芯片雜交和掃描 采用華法林電化學傳感器法，將充分混勻的液體(包括70 μL華法林雜交液Ⅰ,10 μL雜交液Ⅱ,20 μL雜交液Ⅲ和25 μL PCR產物)加入反應管中，雜交反應和分析均在電化學基因傳感器檢測系統進行，最后根據軟件判斷其基因型。

1.2.5結果判讀 華法林敏感基因質控品相應檢測位點基因型結果為430C/C、1075A/A、1080C/C、1173T/T、-1639A/A。

1.3統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CYP2C9 和 VKORC1 基因型芯片雜交情況 本實驗總共發現5種組合基因型，包括C/C、A/C、C/C、T/T、A/A；C/C、A/A、C/C、T/T、A/A;C/C、A/C、C/C、C/T、G/A;C/C、C/C、C/C、T/T、A/A;C/C、A/A、C/C、C/T、G/A，見表1～5。

表1 基因型C/C、A/A、C/C、C/T、G/A情況

表2 基因型 C/C、C/C、C/C、T/T、A/A情況

2.2CYP2C9和VKORC1兩種基因組合的構成情況 C/C、A/C、C/C、T/T、A/A 3例(1.5%)，C/C、A/A、C/C、T/T、A/A 140例(69.3%)，C/C、A/C、C/C、C/T、G/A 12例(6.0%)，C/C、C/C、C/C、T/T、A/A 2例(1.0%)，C/C、A/A、C/C、C/T、G/A 45例(22.2%)。

2.3CYP2C9 和VKORC1基因的分布情況 202份樣本中共檢測到CYP2C9*2位點基因型C/C 202例(100.0%)，等位基因C頻率為100.0%；CYP2C9*3位點基因型A/A 185例(91.6%)、A/C 15例(7.4%)、C/C 2例(1.0%)，等位基因A頻率為95.3%，C為4.7%；CYP2C9*5位點基因型C/C 202例100.0%,等位基因C頻率為100.0%。202份樣本中共檢測到VKORC1的-1639G/A位點基因型A/A 145例(71.8%),G/A 57例(28.2%)，等位基因A頻率為85.9%，G為14.1%；1173T/C位點基因型T/T 145例(71.8%),C/T 57例(28.2%)，等位基因T頻率為85.9%，C為14.1%，見表6。

表3 基因型C/C、A/A、C/C、T/T、A/A情況

表4 基因型C/C、A/C、C/C、T/T、A/A情況

表5 基因型C/C、A/C、C/C、C/T、G/A情況

表6 CYP2C9和VKORC1基因型及基因頻率分布情況

3 討 論

CYP2C9是人體肝細胞中CYP450酶系中重要成員之一,能代謝大量重要的臨床藥物，是華法林代謝的關鍵酶，CYP2C9基因具有高度遺傳多態性，存在野生型CYP2C9*1和突變型CYP2C9(*2～*13)。本研究選取CYP2C9*2、CYP2C9*3和CYP2C9*5位點進行研究，結果發現CYP2C9*2和CYP2C9*5位點基因型均為敏感基因型，只有CYP2C9*3基因分布頻率具有明顯種族差異。CYP2C9*3主要是第359位的氨基酸由異亮氨酸變成亮氨酸,導致底物識別位點的一個β折疊破壞,改變酶的結構,使酶的催化能力降低80%，CYP2C9*3突變攜帶者華法林劑量需求較野生型患者低[2-5]。

本研究結果顯示，云南地區漢族人群CYP2C9*3位點基因型A/A 185例(91.6%)、A/C 15例(7.4%)、C/C 2例(1.0%)，等位基因A和C頻率分別為95.3%和4.7%，上海漢族人群分別為95%、5%、0、98%和2%[6]，皖南漢族人群分別為94.7%、5.19%、0.74%、96.6%和3.33%[7]，差異無統計學意義(P>0.05)。CYP2C9*3基因的華法林敏感性基因型為A/A，云南地區漢族人群A/A型占91.6%，提示臨床維持經驗用藥。

VKORC1主要由VKORC1基因編碼，其編碼的產物VKORC1是復合脂蛋白酶系，存在于內質網膜上。通過阻礙維生素K由氧化型轉化為有活性的氫醌型，阻斷維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的活化而發揮抗凝作用[8-9]。本文研究的主要位點是位于啟動子區-1639G>A和內含子區1173C>T等位基因位點。-1639G>A和1173C>T兩個位點在亞洲人群中呈現強烈連鎖不平衡[10]，研究表明，VKORC1相關等位基因與華法林高劑量相關。G/G和A/G基因型與A/A基因型相比，其啟動子活性高，VKORC1 mRNA表達增加，VKORC1蛋白也相應增加，引起VKORC活性增高，促使凝血因子生成，所以G/G和G/A基因型患者所需華法林劑量高，表現為華法林抵抗。

本研究結果顯示，云南地區漢族人群VKORC1的-1639G>A基因型以A/A為主占71.8%,G/A占28.2%,G/G型未檢出，等位基因A和G頻率分別為85.9%和14.1%，歐美人群分別為12.10%、45.24%、42.65%、34.73%和65.27%，我國漢族人群為77.53%、20.93%、1.55%、87.99%和12.01%[11]，新疆少數民族人群41.70%、44.27%、14.03%、36.17%和63.83%[12]，差異有統計學意義(P<0.05)。A/A基因型患者所需的平均華法林維持劑量較G/A基因組的患者少[8]。我國新疆少數民族的A/A基因型則較漢族明顯偏低，推測云南少數民族的相關基因可能與云南漢族有差異。本研究結果顯示，云南漢族人群的VKORC1的-1639G>A和1173C>T的突變率較高，建議臨床醫生在給患者實施華法林治療時需要檢驗VKORC1基因。

本文通過對202例云南漢族人群華法林相關藥物遺傳學基因CYP2C9和VKORC1的研究發現，云南漢族人群CYP2C9基因分布情況與我國其他地區漢族人群一致，VKORC1基因與國外人群、我國漢族人群、新疆少數民族人群的基因分布有差異。目前針對云南地區各少數民族人群的研究較少，應加強進一步研究，從而推動云南地區華法林個體化用藥的發展。

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