兩種人牙源性iPSCs的重編程效應及生物學特性比較*

郭 宇，徐靜舒，戴青原，譚小兵△

(1.云南省第一人民醫院口腔醫學中心，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，昆明 650032)

最近研究發現特定轉錄基因可使終末分化體細胞重新獲得干細胞特性，命名為誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)[1-2]，iPSCs無論在形態和功能等方面均與胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)非常相似，是近年來干細胞領域的重要里程碑[3]。iPSCs技術可產生患者特異性干細胞用于疾病模型研究和細胞治療，為個性化治療打下了基礎[4]。

iPSCs要應用于臨床治療就必須保持原有基因完整性，不能攜帶任何外源性病毒或基因。目前許多方法均可產生iPSCs，包括腺病毒、游離型載體、質粒，合成mRNA、miRNAs等，但都存在一定缺陷，如重編程效率低下、程序繁瑣等[5]。筆者的前期研究也將人牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)和根尖乳頭干細胞(stem cells from apical papilla，SCAP)重編程為iPSCs[6-7]，但iPSCs攜帶有致瘤基因，且誘導效率不高，限制了其進一步應用。

為建立更高效、更安全的重編程方法，本研究采用一種新型RNA載體(仙臺病毒)將人DPSCs和SCAP重編程為iPSCs，比較兩種iPSCs的克隆形態、誘導效率、誘導時間等生物學特性，為iPSCs用于干細胞治療提供更理想的細胞來源。

1 材料與方法

1.1主要試劑 α-MEM(minimum essential medium)培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)購自美國Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶購自美國Roche公司；基質膠(Matrigel，生長因子減少型)購自美國BD公司；TriZOL總RNA提取試劑盒、 SuperScript?Ⅲ Ofne-Step RT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；CytoTune?-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit試劑盒購自美國Life公司；重編程培養基、PSC-easy iPS細胞培養基、基質膠、人胚胎干細胞(H9)購自北京賽貝生物科技公司。

1.2方法

1.2.1分離培養 收集云南省第一人民醫院口腔頜面外科2017年1月拔除的年輕患者下頜第3磨牙。采用BAKKAR等[8]方法進行培養：收集牙髓、根尖乳頭組織，充分剪碎，37 ℃、Ⅰ型膠原酶/中性蛋白酶(3∶4 mg/mL)消化60 min，過細胞濾器(70 μm直徑)得到單細胞懸液，加入完全培養基(α-MEM+15%FBS+1%谷氨酰胺+1%青/鏈霉素)，37 ℃、5% CO2常規培養、傳代，第3～5代細胞用于后續實驗。所有實驗均經云南省第一人民醫院倫理委員會批準(2013YL023)并取得患者書面同意。

1.2.2重編程 嚴格按照Sendai Reprogramming Kit試劑盒進行操作，底物為基質膠(終濃度50 μg/mL)，人H9為標準對照。轉染前2 d：6孔板常規培養人DPSCs和SCAP(第3代，每孔1×105)，轉染當天細胞70%融合。轉染當天(第0天)將適量SeV溶解到70 μL完全培養基，加入6孔板，1 d后(第1天)再加入130 μL完全培養基，第2天換新鮮培養液(含SeV)繼續轉染。第3天收集已轉染細胞，轉移到基質膠覆蓋6孔板，重編程培養基繼續培養，3周左右可觀察到小克隆出現。克隆成熟時，“十字分割法”分離克隆，轉移到新培養板(基質膠覆蓋)，PSC-easy培養基(含10 μmol/L Y27632)培養。SeV重編程過程見圖1。

圖1 仙臺病毒重編程簡圖

1.2.3兩種牙源性iPSCs克隆形態、重編程時間、重編程效率 克隆形態：觀察iPSCs在不同體系底物上的生長情況(人H9為標準對照)；重編程時間：計算從接種開始到ES樣克隆出現的時間，即為該克隆形成時間(誘導時間)，重復3次，取平均值；重編程效率：確定精確的重編程效率非常復雜，出現克隆數占重編程體細胞數量的比例是一個重要參數。計算公式：克隆數/體細胞數量×100%，重復3次，取平均值。

1.2.4逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) 收集兩種牙源性iPSCs(第12代，5×106個)，TriZOL試劑盒提取總RNA，取1 μL RNA，NanoDrop 2000分光光度機(美國Thermo公司)測量濃度，嚴格按照一步法RT-PCR試劑盒說明書進行反應。反應條件：反轉錄45 ℃ 30 min；PCR反應程序：95 ℃ 2 min，35次循環(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 5 min。結束后取5 μL反應產物，加入上樣緩沖液電泳檢測，GAPDH為管家基因。SeV：上游引物5′-GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C-3′，下游引物5′-ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC-3′；KOS：上游引物5′-ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC-3′，下游引物5′-ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG-3′；Klf4：上游引物5′-TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C-3′，下游引物5′-AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA-3′；c-Myc：上游引物5′-TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G-3′，下游引物5′-TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG-3′；GAPDH：上游引物5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3′，下游引物5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′。

2 結 果

2.1人DPSCs、SCAP的原代培養及重編程 體外培養第1天可見單細胞貼壁生長，第4天形成克隆，1周左右長滿培養瓶。 DPSCs表現為多角形或長梭形，而SCAP多為成纖維細胞樣或星形，很快形成致密單細胞層。SeV轉染細胞接種到基質膠3～4 d可觀察到纖維細胞樣克隆出現，3～4周形成ES樣克隆，質地均勻、排列緊密、邊緣清晰，此為iPSCs第0代。挑取成熟iPS克隆繼續培養，此為iPSCs第1代，以后用EDTA液消化傳代，細胞維持ES樣克隆特征。隨機選擇克隆長期培養，細胞形態穩定，邊緣或內部未見分化。 RT-PCR結果表明，兩種iPSCs均不表達外源性病毒或轉錄基因序列，具備臨床應用安全性。見圖2。

A：hDPSCs(P0,3 d,×100);B：hDPSCs(P0,8 d,×100);C:hSCAP(P0,3 d,×100);D：hSCAP(P0,8 d,×100);E:hDPSCs-iPS(P10,3 d,×100);F:hSCAP-iPS(P10,8 d,×100);G:H9(P52,3 d,×100);H:人DPSCs、SCAP(P15)RT-PCR結果

圖2人DPSCs、SCAP原代培養、誘導后iPS細胞形態及RT-PCR結果

2.2人DPSCs、SCAP的重編程效率和時間 人DPSC、SCAP重編程前細胞數量大約為1×104個，重編程后分別得到68和70個左右克隆，重編程效率為(0.68±0.02)%、(0.70±0.01)%，差異無統計學意義(P>0.05)。人DPSCs與SCAP重編程時間分別為(26.0±2.1)、(27.0±1.4)d，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

A：人DPSCs、SCAP重編程效率比較；B：人DPSCs、SCAP重編程時間比較

圖3人DPSCs、SCAP的重編程時間及效率比較

3 討 論

重編程技術的出現對干細胞研究具有重大意義，iPSCs的產生避免破壞胚胎，無免疫排斥反應，最終目的是產生患者特異性干細胞用于再生治療[9]。早期利用病毒性載體在體細胞內過表達轉錄基因使其重新獲得干細胞特征，后續也有研究應用非病毒性載體進行重編程，但普遍存在效率低下、方法復雜等缺點[10]。仙臺病毒為15 kb單鏈RNA病毒，不會結合到宿主細胞基因組內，轉錄基因表達效率高，病毒及轉錄基因隨著iPSCs的傳代而逐漸消除，是理想的重編程轉錄基因的載體[11]。

iPSCs重編程技術出現以來，多種體細胞均重編程為iPSCs，包括皮膚成纖維細胞、外周血細胞、腎上皮等[12]，獲取方式多為有創性操作。人第3磨牙常因阻生需要拔除，臨床常常丟棄處理。年輕人第3磨牙含有豐富牙髓和根尖組織，易于分離培養DPSCs和SCAP，來源簡便、無創，誘導效率也較傳統方法高[6-7]。有研究表明，越是處于分化早期的幼稚細胞越容易誘導為iPSCs。誘導時間與誘導效率可作為客觀指標衡量誘導為 iPSCs的能力[13]。本研究利用仙臺病毒轉染人DPSCs和SCAP，結果發現兩種細胞均有較高誘導效率(0.7%左右)，可能與它們能表達內源性重編程基因Klf4、ES細胞相關基因Nanog及較高增殖效率等有關[14]，與MIERE等[15]的研究結果一致。

體細胞重編程機制重點在于核心多潛能性轉錄基因網絡，包括正常細胞發育過程中相關基因的表觀遺傳調控。重編程基因、miRNA和小分子調控iPSCs產生的表觀遺傳基因，包括DNA甲基化、組蛋白去甲基化、染色質重組等[16]。iPSCs維持多潛能性的基因主要是Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog。Oct4來自轉錄基因POU家族，主要作用為維持細胞多潛能性，能抑制分化相關基因的表達，其位點測序結果顯示有廣泛去甲基化，Oct4基因對形成和維持iPSCs的多能性和自我更新是和Sox2和Nanog共同完成的[17]。Sox2是性別決定區-Y框蛋白-2相關基因，在應答白血病抑制因子反應時激活，主要調控JAK-STAT信號通路，信號通路的下調導致Sox2激活[18]。Nanog在篩選維持ESCs特性的轉錄基因時出現，與Oct4和Sox2一起支持內細胞層，也是多潛能細胞維持自我更新的必需因素[19]。c-Myc是一種原癌基因，在重編程過程中發揮催化作用，能增加iPSCs的生成效率。c-Myc與Klf4的相互作用對重編程至關重要，c-Myc可增加增殖效率，但過多表達會增加p53水平，而Klf4能增加p21水平使增殖效率降低，同時降低p53水平以減少細胞凋亡的風險[20]。iPSCs重編程所需時間通常為16～35 d，編程時間的長短反映了重編程的難易程度，同時也體現出重編程過程中變異的風險[21]。

本研究所用仙臺病毒能編碼Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4種基因，具備良好的重編程效率，兩種細胞誘導時間為27 d左右，與LIEU等[22]的研究結果相似；得到的iPSCs經RT-PCR證實已無病毒或轉錄基因序列的表達，與CHICHAGOVA等[23]研究結果一致。與ZOU等[7]利用慢病毒hSTEMCCA-loxP將hSCAP重編程為TF-iPSCs相比，本研究無需后期切除外源性轉錄基因，程序簡便，重編程效率較高。同時筆者采用無飼養層體系(基質膠)為培養底物，最大程度減少了外源性因素對iPSCs的影響。

本研究成功利用仙臺病毒將人DPSCs和SCAP重編程為iPSCs，取材方便、無創，誘導效率高，得到的iPSCs具備典型干細胞生物學特征，為產生符合臨床應用標準的iPSCs及干細胞治療提供可靠的細胞來源和重編程方法。

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