Bax、Bmi-1及PCNA在膠質瘤中的表達及意義*

續 嶺，王 金，謝明祥，肖順武，唐懷波，吳海濤，申 昊，趙洪新，猶春躍△

(遵義醫學院附屬醫院:1.神經外科;2.神經內科，貴州遵義 563003)

膠質瘤是最為常見的惡性顱內腫瘤之一，占中樞神經惡性腫瘤的40%～50%，發病率、復發率及病死率居高不下。膠質瘤由于組織塊生長迅速，侵襲性強致使組織邊界模糊，依靠手術難以將腫瘤組織切除干凈，導致術后患者預后較差[1-2]。因此為提高膠質瘤的治療效果，進一步明確其發病機制至關重要。腫瘤的發生、發展與癌基因的激活，抑癌基因的失活，細胞凋亡基因及細胞增殖基因的異常表達等密切相關，膠質瘤也不例外[3]。Bcl-2家族是最為常見的細胞凋亡調控家族，B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bax)是其中的促凋亡蛋白，能自身形成二聚體，傳遞凋亡信號，誘導細胞凋亡，在眾多腫瘤組織中低表達[4]。B細胞特異性Moloney小鼠白血病病毒整合位點1(Bmi-1)是多梳家族(PcG)成員之一，被認為是一種原癌基因，能與Bcl-2家族蛋白相互作用，抵抗細胞凋亡，在多種腫瘤組織中高表達[5-6]。增殖細胞核抗原(PCNA)是一種評價細胞增殖狀態的核蛋白，與細胞有絲分裂密切相關，在眾多腫瘤組織中高表達[7]。研究已證實Bax、Bmi-1及PCNA在膠質瘤中異常表達[4-7]，但三者在膠質瘤的聯合檢測及意義尚未見報道，因此本研究將對此展開探討，以期對膠質瘤的診斷及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年12月至2016年11月經遵義醫學院附屬醫院手術切除并經病理科病理診斷證實為腦膠質瘤的組織標本98例，其中男54例，女44例，中位年齡45歲。按WHO 2007年神經系統腫瘤分類標準：Ⅰ級22例，Ⅱ級24例，Ⅲ級29例，Ⅳ級23例。另取48例同時期由于顱腦外傷進行內減壓手術的腦組織標本作為正常對照。所有患者手術前均無化療、放療及生物治療等，均經醫院倫理學委員會同意及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法檢測Bax、Bmi-1及PCNA表達 將石蠟標本置于二甲苯，無水乙醇，95%、85%、75%乙醇中脫蠟，接著將標本置于檸檬酸鹽抗原修復盒中修復。10%山羊血清室溫下封閉30 min。一抗(兔抗Bax、Bmi-1及PCNA多克隆抗體，稀釋度1∶200)溶液，4 ℃過夜孵育，第2天于二抗溶液室溫下孵育1 h，二氨基聯苯氨(DAB)顯色后沖洗。蘇木素復染、1%鹽酸分化，氨水反藍。梯度乙醇中脫水，二甲苯中透明，中性樹脂封片，并于顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.2.2Western blot檢測細胞中Bax、Bmi-1及PCNA蛋白表達 將組織標本勻漿并加入細胞裂解液裂解，離心，收獲上清液即是總蛋白。利用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白水平。制作濃縮膠和分離膠，并水封靜置30 min。進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人Bax、Bmi-1、PCNA、GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)孵育，4 ℃過夜；第2天二抗溶液室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統中曝光。

1.2.3結果判斷 Bax蛋白主要是以在細胞質中出現棕黃色或者棕褐色的顆粒作為陽性表達；Bmi-1及PCNA蛋白主要是以細胞核中出現棕黃色或者棕褐色的顆粒為陽性表達。由工作經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法閱片并確診。隨機選擇高倍鏡的5個視野進行觀察并計數。該切片的總得分是陽性細胞所占百分率評分乘以染色評分。按細胞的染色程度評分：未染色的標為0分，染淺黃色的標為1分，染棕黃色的標為2分，染棕褐色的標為3分。按陽性細胞所占百分率評分：未染色的標為0分，<25%標為1分，25%～<50%標為2分，≥50%標為3分。

2 結 果

2.1免疫組織化學檢測Bax、Bmi-1及PCNA在膠質瘤及正常組織中的表達 膠質瘤組織中Bax陽性率顯著低于正常組織(P<0.05)，Bmi-1及PCNA陽性率均顯著高于正常組織(P<0.05)，見表1。

表1 Bax、Bmi-1及PCNA在膠質瘤及正常組織中的陽性表達[n(%)]

2.2Bax、Bmi-1及PCNA陽性表達與膠質瘤級別的關系 Ⅲ～Ⅳ級中Bax陽性率顯著低于Ⅰ～Ⅱ級(P<0.05)，Bmi-1及PCNA陽性率均顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(P<0.05),見表2。

A：膠質瘤組織；B：正常組織

圖1 Western blot檢測Bax、Bmi-1及PCNA在

膠質瘤及正常組織中的蛋白表達

A：Ⅰ～Ⅱ級；B：Ⅲ～Ⅳ級

圖2 Bax、Bmi-1及PCNA蛋白表達與膠質瘤級別的關系

2.3Bax、Bmi-1及PCNA在膠質瘤及正常組織中蛋白表達 膠質瘤組織中Bax蛋白表達量顯著低于正常組織(P<0.05)，Bmi-1及PCNA蛋白表達量均顯著高于正常組織(P<0.05)，見圖1。

2.4Bax、Bmi-1及PCNA蛋白表達與膠質瘤級別的關系 Ⅲ～Ⅳ級中Bax蛋白表達量顯著低于Ⅰ～Ⅱ級(P<0.05)；Bmi-1及PCNA蛋白表達量均顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(P<0.05)，見圖2。

2.5膠質瘤組織中Bax、Bmi-1及PCNA表達的關系 經Spearman相關性分析表明，Bax與Bmi-1、PCNA表達呈負相關(r=-0.438、-0.527，P=0.000)，Bmi-1與PCNA表達無關(r=0.231，P>0.05)。

3 討 論

眾多研究表明，原癌基因的激活、抑癌基因的失活、細胞凋亡相關基因及細胞增殖相關基因的異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關，進而提示檢測腫瘤組織中細胞凋亡相關基因的表達可能成為腫瘤診斷、預后的有效手段[3]。Bax是于1993年在人和鼠B細胞中發現的一種促凋亡蛋白，能自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，促使Caspase家族信號放大，最終誘導細胞凋亡。目前研究顯示Bax在包括膠質瘤中的多種腫瘤組織中低表達甚至缺失，楊立軍[4]的研究證實膠質瘤組織中的Bax陽性率顯著低于正常腦組織，且隨腫瘤級別提高陽性率逐漸下降。于澤奇等[8]研究也證實隨著膠質瘤級別的升高，Bax陽性率逐漸降低(100%、82.4%、16.1%)。本研究免疫組織化學及Western blot結果表明膠質瘤組織Bax的蛋白表達量及陽性率均顯著低于正常組織，且Ⅲ～Ⅳ級的表達量及陽性率低于Ⅰ～Ⅱ級，與楊立軍[4]，于澤奇等[8]研究結果一致。說明Bax的表達水平對膠質瘤的惡性程度起到診斷作用，對患者預后評估具有重要意義。

Bmi-1是1991年荷蘭癌癥中心發現的一種與c-myc同源的原癌基因，能夠通過調控組蛋白的乙酰化與去乙酰化過程，影響細胞的增殖與凋亡[5-6]。研究顯示Bmi-1在多種腫瘤組織中異常表達，與腫瘤的發生、發展密切相關。MADATHAN等[9]采用SYBR?qRT-PCR及Westernn blot方法檢測50例膠質瘤組織中Bmi-1 mRNA及蛋白表達，結果表明膠質瘤中Bmi-1 mRNA(36/50，72.0%)及蛋白(37/50，74.0%)表達量顯著高于正常腦組織。單嶠等[10]證實膠質瘤組織中Bmi-1蛋白及mRNA表達量顯著高于正常腦組織。本研究免疫組織化學及Western blot結果表明膠質瘤組織Bmi-1的蛋白表達量及陽性率均顯著高于正常組織，與上述研究一致。且本研究還表明Ⅲ～Ⅳ級中Bmi-1的表達量及陽性率高于Ⅰ～Ⅱ級，與王耀東等[6]、單嶠等[10]研究結果一致，說明Bmi-1的表達促進了膠質瘤的發展。

PCNA是MAHLER等[7]于系統性紅斑狼瘡中發現的一種細胞核蛋白，是DNA復制的輔助蛋白，在細胞周期的G0期開始合成，S期達到峰值，是反映細胞增殖狀態的有效標記物。LV等[11]通過Meta分析證實PCNA與膠質瘤、宮頸癌患者5年生存率、高病理級別及高WHO級別密切相關，并提示PCNA可作為宮頸癌、膠質瘤甚至更多腫瘤有效的診斷、預后標記物，或者有效治療靶點。WANG等[12]研究表明PCNA在正常腦組織中不表達，隨著級別的增加PCNA陽性率升高。本研究與WANG等[12]研究結果一致，膠質瘤組織中PCNA陽性率及蛋白表達量顯著高于正常組織，且病理級別研究還顯示Ⅲ～Ⅳ級中PCNA的表達量及陽性率高于Ⅰ～Ⅱ級。從而說明PCNA的表達與膠質瘤的進展密切相關，PCNA可能成為膠質瘤治療的有效靶點。

本研究經Spearman相關性分析證實膠質瘤中Bax與Bmi-1、PCNA表達呈負相關，Bmi-1與PCNA表達無關。有研究證實肺癌患者血清中PCNA與Bax表達呈負相關，二者聯合檢測對肺癌患者的診斷及預后具有重要意義[13]。喉鱗癌中Bax及Bmi-1表達呈負相關，且低表達的Bax、高表達的Bmi-1能顯著促進喉鱗癌的發展[14]。PCNA及Bmi-1在皮膚鱗狀細胞癌中的表達無相關性，提示二者獨立影響皮膚鱗狀細胞癌的分化、浸潤及轉移[15]。從而說明Bmi-1及Bax，PCNA及Bax對膠質瘤的惡性發展具有相關的機制調控，而Bmi-1及PCNA對膠質瘤的發展具有獨立作用，互不干擾。

綜上所述，Bax在膠質瘤中低表達且陽性率隨著病理分級升高而降低，PCNA與Bmi-1在膠質瘤中高表達且陽性率隨著病理分級升高而提高，三者聯合檢測可成為膠質瘤預后的標記物。

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