細胞內Ca2+及其在卵母細胞成熟中的作用

馬薇薇，蔣春艷，崔毓桂

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科，南京 210029)

細胞生物學中普遍存在Ca2+介導的胞內信號傳導模式，由細胞內Ca2+濃度和空間分布的變化構成。Ca2+參與調控機體幾乎所有的生物學功能，諸如心臟和肌肉收縮、神經信息傳遞、胚胎形成和發育、細胞增殖和凋亡、細胞能量代謝等等。但長期的細胞內高Ca2+具有細胞毒性，可觸發細胞死亡。因此，波、尖峰或震蕩形式的鈣信號必須受到嚴密的調控。多種多樣的離子通道、離子泵以及轉運體的協同工作，形成了細胞膜內外和細胞器內外陡峭又嚴格受控的Ca2+濃度梯度[1]。卵母細胞成熟是細胞周期的轉化過程，受到Ca2+的嚴密調控。Ca2+促使卵母細胞從減數分裂阻滯期恢復，從而促進卵母細胞成熟。

一、細胞內鈣的調節

細胞質內Ca2+濃度維持約100 nmol/L，這是胞內鈣信號的背景基礎。胞外Ca2+濃度約為1～2 mmol/L，細胞內Ca2+儲存庫(主要是內質網)中的Ca2+濃度在250～600 μmol/L。鈣信號產生是由于細胞外Ca2+的內流，或是細胞內的Ca2+庫外流。內質網和質膜上的通道和鈣泵相互協作，調節內質網和細胞質中的鈣穩態[1]。

1.細胞膜的鈣調節：細胞膜主要的Ca2+通道包括瞬時感受器電位通道(transient receptor potential，TRP)、電壓門控鈣通道(voltage-gated calcium channel，VGCC)和庫控鈣內流(store-operated Ca2+entry，SOCE)。它們介導細胞外Ca2+流入細胞質，而鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchange，NCX)、Ca2+-ATP酶等轉運蛋白則負責將Ca2+移出細胞[2]。

TRP通道在各器官分布廣泛，對Na+、K+和Ca2+都有通透性。對Ca2+的通透性會因亞型不同而有很大差異，按照基因同源性可以分為6個家族。TRP通道可被多種因素調節，如溫度、滲透壓、pH 值、機械力、配體等[3-4]。

VGCC對腦、骨骼肌、心肌、平滑肌、內分泌腺以及其他可興奮細胞的生理功能至關重要。這些膜蛋白將細胞膜去極化信號轉換為快速、局部的胞質鈣濃度變化，繼而觸發分泌、收縮、遷移和基因轉錄等關鍵生物學事件[3-4]。

當內質網中的鈣儲量下降時，Ca2+可以從細胞外進入細胞，這一過程稱為庫控鈣內流。它的機制主要涉及細胞膜上的鈣釋放激活的鈣通道蛋白1(ORAI1)和內質網上的基質相互作用分子1(STIM1)。機制在內質網鈣調節時詳述[3-4]。

細胞質中低濃度的Ca2+主要由Ca2+-ATP酶維持。它們迅速地將胞內Ca2+泵回到細胞器內(如內質網)，或泵出到細胞外空間。這些Ca2+-ATP酶根據其亞細胞定位，可進一步分為三個亞型：質膜Ca2+-ATP酶(PMCA)、內質網/肌漿網Ca2+-ATP酶(SERCA)和高爾基體、高爾基體的囊泡分泌途徑Ca2+-ATP酶(SPCA)。每個亞型包含多個異構體和剪接變異體，其表達、調節和動力學特性皆呈現組織特異性。因此，Ca2+-ATP酶有助于形成一個高度復雜而精細的細胞內Ca2+信號網[1-2]。

2.內質網鈣的調節：細胞內Ca2+高度集中在內質網中，它不是簡單的儲存場所，而是一個動態的存儲場所，它通過釋放或吸收鈣來對電和化學刺激作出反應，從而有利于快速的生理性鈣信號介導。而Ca2+耗竭既是內質網應激的原因，也是內質網應激的結果。內質網主要通過雷尼丁受體(RyR)和1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)釋放Ca2+[5]。內質網Ca2+耗竭時，由肌漿網/內質網Ca2+-ATP 酶(SERCA)和基質相互作用分子1(STIM1)維持細胞內鈣穩態[6-7]。

RyRs是位于肌漿網/內質網膜的Ca2+通道，主要在可興奮細胞中表達。在肌肉中，通過開啟肌漿網的RyRs，Ca2+才得以釋放。哺乳動物有三種不同亞型的RyRs，但沒有一個是完全特異性的亞型。RyR1主要表達于骨骼肌，骨骼肌肌質網上的RyR1與細胞膜二氫吡啶受體(DHPR)分子間相互作用，當動作電位引起細胞膜去極化，DHPR的構象變化激活RyR1 產生電壓依賴性鈣釋放；RyR2主要表達在心肌，心肌細胞興奮前，首先通過L型Ca2+通道使細胞外少量的Ca2+內流，內流的Ca2+誘導肌漿網內Ca2+通過RyR2釋放至胞漿中，此過程稱之為Ca2+誘導的鈣釋放；RyR3主要表達在大腦和橫膈，也是通過Ca2+誘導鈣釋放的方式激活[8-9]。

IP3R是一個專門的受體門控鈣通道，通過1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和鈣調節Ca2+濃度。IP3Rs主要在非興奮性細胞如血管平滑肌和呼吸平滑肌中表達。當IP3與IP3R 結合，使通道開放，將Ca2+釋放到細胞質中，而這一過程進一步激活IP3敏感的鈣庫釋放Ca2+。該反應導致局部Ca2+增加，促進鈣結合在IP3R第二位點，使IP3R通道失活，終止鈣的釋放。肌漿網中Ca2+減少也有助于終止Ca2+的釋放[3，8]。

STIM1是肌漿網的膜蛋白，作為Ca2+傳感器，向質膜Ca2+通道傳遞信息。當內部存儲的Ca2+下降時，STIM1可形成點狀結構聚集在肌漿網上，并促使肌漿網靠近質膜，與細胞膜上的鈣釋放激活的ORAI1相互作用，使得Ca2+進入細胞內[3，7]。而SERCA作為內質網/肌漿網主要的鈣泵，每水解1分子ATP，將從胞漿運輸兩個Ca2+到內質網，因此通過ORAI1進入細胞質的Ca2+，被SERCA回收到內質網中。鑒于SERCA泵對鈣代謝的重要性，它們的活動受多層次的嚴格管制，包括基因轉錄、蛋白表達、與內源性蛋白的相互作用，以及各種翻譯后修飾[8]。

3.線粒體的鈣調節：線粒體與內質網之間有緊密的物理聯系，稱作線粒體-內質網結構偶聯。它的主要功能是調控脂質轉運和控制細胞鈣信號。為了攝取鈣，線粒體必須暴露于高鈣濃度，此過程最有可能發生在內質網附近。在接觸部位，Ca2+直接從內質網轉移到線粒體，控制關鍵的線粒體功能，如凋亡和生物合成。此外，線粒體對Ca2+的攝取也參與了鈣信號的轉導，并可防止細胞質內Ca2+的過度升高[10-11]。

線粒體是細胞內的鈣緩沖區，緩沖質膜和內質網的Ca2+流，從而維持鈣穩態。干擾這種鈣緩沖活動將導致胞內鈣異常增加，可激活不同的信號通路，包括鈣和鈣/鈣調蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ型(CaMKⅡ)，導致卵母細胞周期改變。細胞質的Ca2+可以通過線粒體外膜電壓依賴的陰離子選擇性通道(voltage dependent anion-selective channel，VDAC)，先通過線粒體外膜，再通過線粒體內膜依賴單向吸收體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)將Ca2+轉運至線粒體內部。而線粒體內累積的Ca2+最終將通過鈉鈣交換體和氫/鈣轉運蛋白移除[9，12]。

VDAC蛋白是線粒體外膜通道中最豐富的蛋白。它們調節線粒體內外呼吸代謝物的運輸，并且廣泛參與調節代謝物和活性氧自由基(ROS)水平以及內質網和線粒體之間的信號傳導。在哺乳動物中，VDAC有三種同種型，由位于不同染色體上的不同基因編碼。進化最早的同種型是VDAC3，而VDAC1是最主要的。所有的同種型都在哺乳動物線粒體中普遍表達，但在物種間有差異，而個體的表達水平在不同組織之間也有變化。細胞VDAC位于外線粒體膜中，所有三種同種型都與線粒體結合內質網膜(mitochondria-associated ER-membrane，MAM)密切相關。許多蛋白質組學研究的發現表明，所有的同種型都可能參與線粒體-內質網結構偶聯。VDAC2在HL-1細胞的肌漿網/線粒體結上與RyR2物理相互作用，以產生對線粒體Ca2+攝取至關重要的Ca2+微域[9，12]。

MCU的主要成分仍然未知。作為線粒體內膜攝入Ca2+的唯一來源，MCU對Ca2+具有低親和力。這一特性可以解釋為線粒體通常緊鄰內質網/肌漿網膜中IP3R或RyR Ca2+的出口處，能夠感測具有高Ca2+濃度的微區域，因而補償了MCU的低親和力。這種機制可以控制線粒體膜上的Ca2+運輸，并阻止線粒體Ca2+過載[12]。

4.細胞內鈣結合蛋白：Ca2+可以直接傳遞信息，也可以結合酶位點，并升高或者降低酶的活性。但是，在大多數情況下，Ca2+并不直接傳遞信息。Ca2+信號不同的振幅、頻率和位置可編碼多種信息，這些信息可以由鈣結合蛋白破譯。鈣結合蛋白是能夠與Ca2+特異性結合的一類蛋白質的總稱，具有EF-手的結構特征。EF-手結構是Ca2+結合區，每個EF-手有兩個Ca2+結構域，可以各結合一個Ca2+。迄今為止發現了超過800種鈣結合蛋白，其中，有100多種蛋白的三維立體結構被揭示。然而，它們精確的功能依然未知。重要的鈣結合蛋白都是EF-手結構蛋白，如鈣調蛋白(Calmodulin)、肌鈣蛋白C(troponin C)、恢復蛋白(recoverin)、S-100、STIM(基質相互作用分子)，它們都結合Ca2+并傳遞信號。其他EF-手結構蛋白，例如小清蛋白、鈣視網膜蛋白可以維持Ca2+的動態平衡。這些蛋白質大多含有偶數個的(在2～12之間)EF-手結構[13]。

在進化中，鈣調蛋白(CaM)是最為保守的EF-手結構蛋白。它廣泛存在于所有真核生物中，且在所有脊椎動物中的編碼序列是100%相同的。在人類中，它由三個非等位基因編碼，但盡管蛋白質結構相同，編碼序列卻差異很大。CaM的外形類似啞鈴，有2個相似的球形末端，中間是長的靈活的螺旋結構，且EF-手結構易于成對出現。當CaM與Ca2+結合后，CaM出現構象的改變，暴露蛋白表面的疏水區，與靶蛋白親和性增強，能迅速與靶蛋白結合，調節細胞功能[13-14]。

STIM是內質網膜上的蛋白質，能探測到內質網內的Ca2+的濃度。STIM的EF-手結構是不尋常的，它由典型的和非典型的EF-手結構組成。EF-手結構可結合Ca2+，但非典型EF-手結構中對Ca2+至關重要的氨基酸被替換，影響了與鈣的結合，因此在內質網的Ca2+呈現高濃度時，STIM與Ca2+的親和力比CaM和其他EF-手結構蛋白質低3個數量級。當鈣庫消耗后，Ca2+又從STIM分子的EF-手結構域中解離，STIM的構象改變，與細胞膜上的ORAl1蛋白結合，在內質網與細胞膜之間形成連接，激活鈣通道的開放[11]。

S-100蛋白家族是也是含EF-手的蛋白質家族，因在飽和硫酸銨溶液中可溶而得名。到現在，在人類已經確定21種S-100蛋白。他們很小，通常包含兩個EF-手，在C-末端是典型的EF-手結構，而N-末端的是一個偽EF-手結構，其中14號殘基與Ca2+結合的親和力很低。這些蛋白質也結合其他的二價金屬離子如鋅和銅，并且通常是以同源二聚體形式出現。它們調節許多細胞功能，如轉錄、細胞周期、細胞生長、運動、分化。除了金屬離子，其中一些也與目標蛋白例如細胞外的RAGE(晚期糖基化終產物受體)結合。目前尚不清楚它們是主動分泌還是被動釋放到細胞外。一些S-100蛋白表達的失調會導致不同的疾病表型，包括癌癥[15]。

二、Ca2+的細胞生物學作用

“第一信使”與質膜受體的相互作用，是傳遞信息給細胞的典型方式，而隨之激活擴散的“第二信使”，又將信息傳達到目標細胞。Ca2+就是可擴散的第二信使之一。然而，Ca2+也可以作為第一信使直接進入細胞，將信號攜帶到細胞靶點，與質膜受體的相互作用。而在更多的細胞中，Ca2+則會作為第一信使，與典型的質膜受體結合，觸發第二信使IP3的形成。Ca2+被第二信使IP3釋放到胞質中，稱之為“第三信使”更為正確[16]。

已知Ca2+是體內重要的信號分子，調控許多信號通路。在線粒體中，Ca2+的主要任務是調節ATP的產生。Ca2+依賴性磷酸酶激活丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶，加速三羧酸循環，生成煙酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)，這些電子載體為電子傳輸鏈提供動力，最終產生ATP[17]。

線粒體內鈣超載，尤其是伴隨著氧化應激時，可能會導致線粒體損傷，最終造成細胞死亡。這種鈣超載引起的細胞病理的發生是由于線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的持續開放，mPTP是線粒體內膜一種非特異性孔隙，可通過分子量高達1.5 kDa的分子。mPTP持續開放使得線粒體內膜Ca2+內流的驅動力消散，減少氧化磷酸化和ATP的合成。此外，高膠體滲透壓還會導致線粒體基質腫脹、嵴斷裂展開、內膜斷裂，接著通過凋亡或壞死引起細胞死亡[17-18]。

鈣信號傳導在哺乳動物的整個細胞周期中都起著關鍵作用。在G1期、G1/S轉換和有絲分裂期間，細胞內的鈣濃度在不斷變化。在G1早期，鈣對于FOS、JUN和MYC等基因的表達以及后來的RB磷酸化反應都很重要。而加入鈣調素拮抗劑在G1中觸發細胞周期停滯。鈣調蛋白的下游靶標鈣調蛋白激酶(CaMK)和鈣調神經磷酸酶是細胞周期蛋白D1表達所必需的。鈣/鈣調蛋白通路還可調節幾種轉錄因子，如NFAT(活化T細胞核因子)或cAMP反應元件結合蛋白(CREB)，靶向控制細胞周期從G1進展到S，其中CREB可通過鈣通路被CaMKⅡ和CaMKⅣ誘導磷酸化。磷酸化的CREB與目標基因如細胞周期蛋白 D1啟動子上的cAMP應答元件(CRE)結合，從而激活轉錄[19]。

三、卵細胞中的鈣作用

Ca2+在哺乳動物卵母細胞生理調節中發揮著重要作用。在卵母細胞的成熟過程中，細胞周期會經歷雙線期、MⅠ期和MⅡ期阻滯[20]，而鈣震蕩則使卵母細胞重新進入減數分裂周期。卵母細胞的胞外介質和/或內質網被觸發從而釋放Ca2+，激活CaMKⅡ，誘導ROS生成。CaMKⅡ激活、生理范圍內活性氧ROS水平的升高和cAMP水平的降低直接或間接觸發成熟促進因子(maturation promoting factor，MPF)失衡。不穩定的MPF最后誘導哺乳動物卵母細胞減數分裂從雙線期、MⅠ期和MⅡ期的阻滯中恢復[21]。

在卵母細胞受精的過程中，需要Ca2+震蕩信號維持正常受精完成、啟動胚胎發育信號并維持正常的胚胎發育。Ca2+被釋放到卵母細胞內的確切機制尚未闡明，如今，精子因子假說已得到普遍接受。精子因子(sperm factor，SF)，如磷脂酶C(PLCζ)或后頂體鞘WW結構域結合蛋白(post-acrosomal sheath WW domainbinding protein，PAWP)，擴散到胞質啟動分子級聯反應，該反應主要涉及肌醇磷脂途徑。受精時，PLCζ釋放到胞質，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(hydrolyzes phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2)，生成IP3。IP3與IP3R結合，觸發內質網儲存的鈣釋放。PAWP似乎可與卵母細胞性YAP蛋白(yes-associated protein)結合，最后激活磷酸肌醇信號轉導通路。精子因子的作用導致周期性波樣短暫的鈣釋放，從而產生皮質顆粒的胞吐作用，激活卵母細胞，信號轉導級聯使得卵母細胞受精，轉換成二倍體胚胎[22]。

在卵母細胞成熟和激活的過程中，Ca2+震蕩有著重要的作用，因此維持其在卵母細胞內的穩態是至關重要的。其調控機制主要包括STIM1、ORAI1、SERCA和PMCAs。STIM1作為低鈣水平傳感器，發生改變或不足均可能導致卵母細胞的激活不足，它是精子激活的卵母細胞激活因子(SOAF)觸發生成Ca2+震蕩的關鍵。當PIP2水解為IP3和DAG，IP3與內質網膜上的IP3R結合，這將導致IP3R通道開放，使鈣流出內質網管腔。位于內質網腔的STIM1感受內質網Ca2+濃度降低后，將使STIM1從內質網膜重新定位到質膜，與ORAI1通道直接相互作用。此通道隨后打開，并允許鈣進入細胞。當內質網中Ca2+濃度正常時，STIM1與ORAI1分離，阻止Ca2+內流。除了STIM1和ORAI1，SERCA和PMCAs也參與鈣平衡。SERCA位于內質網膜，將胞漿Ca2+泵到內質網管腔。細胞外Ca2+通過ORAI1和其它膜通道蛋白進入細胞質后，被SERCA泵入內質網中。這使內質網的Ca2+得以補充，而后IP3再與其受體相互作用，從而產生另一個Ca2+震蕩。PMCAs是位于質膜而不是內質網的鈣泵，可將Ca2+從胞外空間泵送到細胞質中。目前，尚不清楚SERCAs和PMCAs的改變是否有可能損害卵母細胞激活的能力。這些蛋白同時作用，使得卵母細胞的Ca2+維持穩態，保證Ca2+信號的傳遞和卵母細胞的激活[23]。

四、IVM中Ca2+的作用

體外成熟(IVM)是指從對竇卵泡提取未成熟卵母細胞，并在實驗室條件下培養成熟的方法。IVM可以減少激素類似物的使用，消除卵巢過度刺激綜合征(OHSS) 和可能的長期并發癥，如激素依賴性腫瘤包括乳腺癌和卵巢癌等，具有一定的臨床優勢[24]。然而，迄今為止，使用年輕女性的卵母細胞獲得的臨床妊娠率仍較低[25]。卵母細胞成熟是一個長期的過程，包括細胞核和細胞質成熟。細胞核成熟主要涉及染色體分離，以出現兩個極體為成熟的標志。細胞質成熟主要涉及細胞器的重新分布以及mRNA、蛋白質和轉錄因子的存儲，以備卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發育之用[5]。細胞質成熟十分復雜，目前仍然有許多研究存在爭議。IVM在誘導減數分裂核成熟方面簡單方便，但在誘導適當的細胞質和分子成熟方面則較為復雜，而這對卵母細胞成熟卻是必不可少的[26]。

在IVM取卵過程中，卵母細胞從卵泡環境中取出時，cAMP濃度急劇降低，卵母細胞減數分裂自發恢復，導致細胞質的不完全成熟。細胞質和細胞核成熟的不同步，將影響卵母細胞的發育和胚胎質量。通過藥理學方法抑制減數分裂一直是許多研究者的努力，其中一些藥物靶向作用于cAMP通路，如cAMP調節劑雙丁酰環腺苷酸(dbcAMP)、磷酸二酯酶抑制劑西洛酰胺(cilostamide)、腺苷酸環化酶的刺激劑福司考林(forskolin)等。這些藥物的目的是為了保持高濃度的cAMP，防止體外卵母細胞核過早成熟，從而提供足夠的時間使得卵母細胞的核和胞漿成熟同步。但這些卵母細胞在處理之后，發育能力通常低于在沒有抑制的情況下培養的卵母細胞[27]。而另一種方法則是調節鈣的信號通路。在真核生物中，MPF是最重要的調節減數分裂細胞周期進程的因子，而Ca2+是卵母細胞中重要的信息傳遞分子，細胞內Ca2+水平增加，將通過CaMKⅡ激活MPF，使細胞核減數分裂繼續進行。使用藥物誘導Ca2+從內部存儲釋放，也可引發體外培養的小鼠、大鼠、牛、豬和人類卵母細胞減數分裂的自發恢復。而早在 1992年，科學家們就已經發現使用BAPTA螯合Ca2+，可以阻止小鼠卵母細胞過早活化的跡象[28]。使用Ca2+通道阻斷劑(維拉帕米和硝苯地平)也能抑制體外培養的小鼠、大鼠、豬和牛卵母細胞減數分裂自發恢復。因此在IVM培養基中添加Ca2+抑制因子，通過阻斷細胞內Ca2+的水平增加從而阻斷MPF的激活，也可以防止卵母細胞核的早熟。

由此可見，對于IVM卵母細胞核與胞漿成熟不同步的問題，使用Ca2+通道阻斷劑是一種很有潛力的解決方案。現在常規使用的IVM培養基都是基礎培養基，如TCM-199 medium、Ham’s-F10 medium和Chang’s medium，用碳酸氫鹽和/或HEPES緩沖，并輔以各種血清促性腺激素(FSH、LH)、生長因子和激素，并沒有重視培養基Ca2+水平及其對于卵母細胞的重要作用[29]。目前發現在囊胚培養基中添加乳酸鈣，似乎對線粒體的功能有積極的作用[30]。但IVM培養基內是否要添加、它的濃度是多少，現在尚未可知。同時IVM過程中，細胞在具有5%二氧化碳(CO2)和約20%大氣氧氣(O2)濃度的細胞培養箱中培養，但是動物體內的氧分壓遠低于大氣氧分壓。細胞暴露于高氧水平能夠增加ROS的產生，可以引起細胞損傷，降低卵母細胞及其胚胎的發育潛能。同時ROS還會調節細胞膜和細胞器的鈣離子通道，改變細胞內的鈣分布，從而激活細胞核的成熟[31]。現在已經發現的抗氧化劑，如槲皮素、維生素C和白藜蘆醇等，均可降低體外成熟卵母細胞中的細胞內ROS水平，提高胚胎數量和質量[32]。

五、總結和展望

Ca2+信號的傳導影響細胞生命和死亡的各個方面。在所有生物體內，Ca2+是受到最嚴密調控的離子，細胞膜和細胞器上存在多種通道的調節，嚴格調控胞內和細胞器中的Ca2+水平。Ca2+結合成千上萬的蛋白質，以影響它們的定位及功能。在卵母細胞成熟中，必須強調鈣信號的發生以及對卵母細胞的影響，以闡明鈣震蕩在卵母細胞成熟和發育中中的必要作用。對卵母細胞成熟過程中鈣調節的研究，有助于了解卵母細胞及胚胎的發生發展機制。卵母細胞成熟異常所導致的受精異常和不受精是IVM成功率低的重要原因之一。目前，為改善IVM中卵母細胞核和細胞質成熟不同步的問題，研究大多集中在阻止cAMP急劇降低，但成功率并沒有顯著提升。而1992年科學家就發現Ca2+螯合劑能阻止減數分裂自發恢復，防止卵母細胞核過早成熟，從而為細胞質成熟提供時間。所以，研究Ca2+在卵母細胞成熟的作用機制，對理解人類卵細胞的發育機制至關重要，該研究的結果將為IVM及體外受精-胚胎移植(IVF-ET)等提供新的理論依據，從而改善卵子質量，提高IVM的成功率。

[1] Machaca K.Ca(2+) signaling，genes and the cell cycle[J].Cell Calcium，2010，48：243-250.

[2] Cui C，Merritt R，Fu L，et al.Targeting calcium signaling in cancer therapy[J].Acta Pharm Sin B，2017，7：3-17.

[3] Perez-Zoghbi JF，Karner C，Ito S，et al.Ion channel regulation of intracellular calcium and airway smooth muscle function[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22：388-397.

[4] Cai X，Wang X，Patel S，et al.Insights into the early evolution of animal calcium signaling machinery：a unicellular point of view[J].Cell Calcium，2015，57：166-173.

[5] Mao L，Lou H，Lou Y，et al.Behaviour of cytoplasmic organelles and cytoskeleton during oocyte maturation[J/OL].Reprod Biomed Online，2014，28：284-299.

[6] Paredes RM，Bollo M，Holstein D，et al.Luminal Ca2+depletion during the unfolded protein response in Xenopus oocytes：cause and consequence[J].Cell Calcium，2013，53：286-296.

[7] Rossi AE，Boncompagni S，Dirksen RT.Sarcoplasmic reticulum-mitochondrial symbiosis：bidirectional signaling in skeletal muscle[J].Exerc Sport Sci Rev，2009，37：29-35.

[8] Chernorudskiy AL，Zito E.Regulation of calcium homeostasis by ER redox：a close-up of the ER/Mitochondria connection[J].J Mol Biol，2017，429：620-632.

[9] Raffaello A，Mammucari C，Gherardi G，et al.Calcium at the center of cell signaling：interplay between endoplasmic reticulum，mitochondria，and lysosomes[J].Trends Biochem Sci，2016，41：1035-1049.

[10] Lopez-Crisosto C，Pennanen C，Vasquez-Trincado C，et al.Sarcoplasmic reticulum-mitochondria communication in cardiovascular pathophysiology[J].Nat Rev Cardiol，2017，14：342-360.

[11] Moccia F，Zuccolo E，Soda T，et al.Stim and Orai proteins in neuronal Ca(2+) signaling and excitability[J].Front Cell Neurosci，2015，9：153.

[12] Prasai K.Regulation of mitochondrial structure and function by protein import：A current review[J].Pathophysiology，2017，24：107-122.

[13] Carafoli E，Krebs J.Why calcium? How calcium became the best communicator[J].J Biol Chem，2016，291：20849-20857.

[14] Bagur R，Hajnóczky G.Intracellular Ca2+sensing：its role in calcium homeostasis and signaling[J].Mol Cell，2017，66：780-788.

[15] Lippi G，Aloe R，Numeroso F，et al.The significance of protein S-100B testing in cardiac arrest patients[J].Clin Biochem，2011，44：567-575.

[16] Clapham DE.Calcium signaling[J].Cell，2007，131：1047-1058.

[17] Vakifahmetoglu-Norberg H，Ouchida AT，Norberg E.The role of mitochondria in metabolism and cell death[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，482：426-431.

[18] Rizzuto R，De Stefani D，Raffaello A，et al.Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13：566-578.

[19] Ziegler DV，Wiley CD，Velarde MC.Mitochondrial effectors of cellular senescence：beyond the free radical theory of aging[J].Aging Cell，2015，14：1-7.

[20] Tripathi A，Kumar KV，Chaube SK.Meiotic cell cycle arrest in mammalian oocytes[J].J Cell Physiol，2010，223：592-600.

[21] Tiwari M，Prasad S，Shrivastav TG，et al.Calcium signaling during meiotic cell cycle regulation and apoptosis in mammalian oocytes[J].J Cell Physiol，2017，232：976-981.

[22] Anifandis G，Messini CI，Dafopoulos K，et al.Sperm contributions to oocyte activation：more that meets the eye[J].J Assist Reprod Genet，2016，33：313-316.

[23] Yeste M，Jones C，Amdani SN，et al.Oocyte activation and fertilisation：crucial contributors from the sperm and oocyte[J].Results Probl Cell Differ，2017，59：213-239.

[24] Makki M，Saboori E，Sabbaghi MA，et al.Effects of selenium，calcium and calcium ionophore on human oocytes in vitro maturation in a chemically defined medium[J].Iran J Reprod Med，2012，10：343-348.

[25] Ellenbogen A，Shavit T，Shalom-Paz E.IVM results are comparable and may have advantages over standard IVF[J].Facts Views Vis Obgyn，2014，6：77-80.

[26] Sirard MA.Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes[J].J Assist Reprod Genet，2011，28：483-488.

[27] Botigelli RC，Razza EM，Pioltine EM，et al.New approaches regarding the in vitro maturation of oocytes：manipulating cyclic nucleotides and their partners in crime[J].JBRA Assist Reprod，2017，21：35-44.

[28] Swann K，Yu Y.The dynamics of calcium oscillations that activate mammalian eggs[J].Int J Dev Biol，2008，52：585-594.

[29] Chian RC，Yang ZY.Development of in vitro maturation for human oocytes[M].Switzerland：Springer International Publishing AG，2017：337-350.

[30] Farsi MM，Kamali N，Pourghasem M.Embryological aspects of oocyte in vitro maturation[J].Int J Mol Cell Med，2013，2：99-109.

[31] Gorlach A，Bertram K，Hudecova S，et al.Calcium and ROS：A mutual interplay[J].Redox Biol，2015，6：260-271.

[32] Sovernigo TC，Adona PR，Monzani PS，et al.Effects of supplementation of medium with different antioxidants during in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent embryo production[J].Reprod Domest Anim，2017，52：561-569.