環狀RNA與女性生殖和妊娠相關疾病

馬志，郝翠芳

(1.青島大學醫學部，青島 266071；2.青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院生殖醫學中心，煙臺 264000)

過去的幾十年，研究者對非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)的探索未曾停歇，miRNA、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)等一系列ncRNAs相繼得以確認，其中各種潛在的功能和機制也被一一闡述。然而，同作為ncRNA家族成員，circRNAs的研究卻顯得尤為緩慢。其實早在1976年，circRNAs就在高等植物類病毒中被發現；僅間隔3年，Hsu等借助電子顯微鏡也在人類細胞中首次觀察到circRNAs。隨后，在DCC(deleted in colorectal cancer)、MLL、ETS-1、Dystrophin和Cytochrome P450 2C18等基因的轉錄物中也均發現了circRNAs的存在[1]。由于與典型線性RNA存在較大結構上的差異且缺乏切實有效的研究手段，circRNAs獨特的環狀結構一度被認為是由錯誤剪接而來，只是轉錄過程的副產品或逃脫內含子套索的中介物，因而未能引起研究者的足夠重視[2]。隨著高通量測序技術的發展、轉錄組學和生物信息技術的不斷成熟，人們對于circRNAs存在的困惑逐漸消除。而在卵巢顆粒細胞及輔助生殖技術植入前胚胎中檢測出大量豐富差異表達的circRNAs也提示其對卵母細胞成熟和胚胎發育或許存在重要的調節作用，本文就近年來circRNAs研究進展及與女性生殖健康的關系作一綜述。

一、CircRNAs的形成

與典型線性RNA剪接模式不同，circRNAs以一種“反向剪接(back splicing)”的方式形成3’-5’或2’-5’相連的共價環狀結構；其可由外顯子、內含子或二者共同構成，也可來源于3’和5’非翻譯區(Untranslated regions，UTRs)[3]。

1.CircRNAs的類別：a.外顯子circRNAs(Exonic cirRNAs，ecircRNAs)環形結構中僅包含外顯子序列，是現階段在動物及植物circRNAs中發現的占比最大的一部分[4-5]。多數ecircRNAs包含5個以內的外顯子，長度從數百至幾千個核苷酸(nucleotide，nt)不等，平均約為547 nt，主要分布在細胞質中，與miRNA和RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)之間密切聯系[6]。b.內含子circRNAs(Intronic circRNAs，ciRNAs) 僅包含內含子序列，約占已發現的人類circRNAs的19.2%，在植物中則鮮有表達[5，7]。ciRNAs是由2’-5’相連而成的環狀結構，其在穩定性、細胞定位、進化保守性和生物學功能等方面均與ecircRNAs存在區別。ciRNAs在胞核中含量較豐富，且其表達與親本mRNA表達呈現正相關性[8]。c.外顯子-內含子circRNAs(Exon-intron circRNAs，EIciRNAs) 由于某種原因導致約20% ecircRNAs中存留部分內含子而形成[9]。EIciRNAs主要分布在胞核，可與RNA 聚合酶Ⅱ(Polymerase Ⅱ，pol Ⅱ)相互作用而促進基因轉錄，側翼內含子(flanking intron)上的反向互補序列可能與其生物合成有關[10]。

2.EcircRNAs和EIciRNAs的形成：外顯子環化由下游的3’尾端(剪接受體)與上游的5’帽端(剪接供體)反向共價連接完成。通常外顯子序列越長，越易成環，這尤其表現在單外顯子ecircRNAs的形成中[11-12]。值得注意的是，一個基因位點可通過“可變環化”(alternative circularization)的方式產生多種ecircRNAs及EIciRNAs[10-11]。反向剪接的機制包括兩種——直接反向剪接和外顯子跳讀(exon skipping)，其中直接反向剪接又可通過兩條途徑完成，即“內含子配對驅動環化”和“RBPs配對驅動環化”，而外顯子跳讀也被稱作“套索驅動環化”[13-15]。直接反向剪接的發生需要多種順式作用元件和(或)反式作用因子的參與，如某些剪接位點旁側翼內含子上的反向互補序列可形成穩定的堿基配對，對提高circRNAs的生物合成十分重要[4，16]。也有研究指出，在線蟲及人中分別有62%和91%的circRNAs并不能形成強的內含子堿基配對[17]。Westholm等[18]在對果蠅的全基因組分析時發現，某些基因位點缺少內含子配對需要的核苷酸模體，卻仍能形成大量的circRNAs。由此看來，單純的內含子配對驅動環化或許并不能很好解釋circRNAs的廣泛存在性。除側翼內含子外，一些特異的RBPs也在circRNAs形成中發揮重要作用，Quaking(QKI)和Muscleblind(MBL)是其中最為典型的代表。研究發現，在側翼內含子上有RBPs特異的結合位點，當敲出QKI基因或過表達MBL基因，可以觀察到circRNAs的表達會相應地顯著下調或上調[19-20]。外顯子跳讀作為mRNA形成過程中一種常見的可變剪接的方式，也同樣影響著circRNAs的合成[15，21]。在跳讀過程中，首先會形成一個同時包含外顯子和內含子的套索，接著在剪接體的作用下，內含子會被全部或部分移除，從而形成成熟的ecircRNAs或EIcircRNAs[14-15]。但成環的過程是否只由套索引起，還是RBPs也參與其中，尚無定論。

3.ciRNAs的形成：不同于外顯子環化，ciRNAs的形成依賴于特定的共有模體(consensus motif)，它包含靠近5’剪接點7 nt長富含GU的序列和分支點附近11 nt長富含C的序列[8]。內含子環化首先需要3’端外顯子的釋放，接著末端游離的2-OH主動“攻擊”5’端內含子-外顯子連接處而形成2’-5’共價環化[22]。由于共有模體的存在，該套索結構可避免脫支酶的作用，最終被RNase剪接為成熟的ciRNA[8]。然而，目前對于共有模體如何能使套索結構逃避脫支作用仍不明確。

二、circRNAs的顯著特性

1.較高的穩定性：環狀RNA呈現特殊的閉合環狀結構，既無5’-3’極性，也沒有ploy A尾，不易被RNase R降解，這就使得其在細胞中具有比線性RNA更高的穩定性：大部分circRNAs半衰期超過48 h，而線性RNA通常小于20 h[4]。有學者在健康個體的不含細胞的唾液(Cell-free saliva，CFS)中檢測出400多種circRNAs，證明circRNAs可穩定存在于各類細胞外體液之中[23]。

2.分布廣泛，種類繁多：現有研究表明，circRNAs在真核生物體內廣泛表達，其中人體細胞中存在的circRNAs占所有轉錄本的10%以上[24]，某些circRNAs的豐度甚至超過相應的mRNA 10倍之多，但大部分還是以低水平表達為主[4]。Jeck等[4]運用高通量測序從人纖維母細胞中檢測出超過25 000種穩定存在的ecircRNAs；新近發現[25]，人心源性circRNAs的種類也多達15 300余種。Max Delbruck分子醫學中心(MDC)建立的環狀RNA數據庫circBase中的circRNAs已超過40萬種，其中來自人類細胞的有35萬余種。

3.進化較為保守：在繁雜的circRNAs研究中，學者們驚訝的發現，其中許多circRNAs擁有大量保守序列。Salzman等[26]指出，人與小鼠的同源基因中約4%可形成circRNAs；EcircRNAs較其他circRNAs可表現出更為廣泛的序列保守性，尤其在第3個密碼子的位置[3]。CircRNAs在不同物種間的保守性或許暗示，其并不能被簡單地看作pre-mRNA剪接過程的副產物，而是可能在某些基本的生命過程中起到重要作用。但也有實驗顯示，小鼠與人同源基因circRNAs中的外顯子并不比其相鄰的線性RNA中的外顯子表現出更強的保守性[9]。不過，在許多物種間都觀察到，circRNAs側翼長內含子序列的存在，這些長內含子本身并不導致circRNAs的形成，但其包含的反向互補序列可促進成環作用，是動植物中的一種保守特性[4-5，24]。

4.表達的時空特異性：circRNAs的表達在不同的組織細胞及發育階段通常各不相同(tissue/developmental-stage specific expression)，即所謂的時空特異性表達(spatiotemporal specific expression)。例如，hsa_circRNA_2149可在CD19+白細胞中檢測到，但在CD34+白細胞、中性粒細胞以及HEK293細胞中均無表達[27]；某些circRNAs在線蟲卵母細胞中表達，但在1或2細胞胚胎階段卻又消失了[3]；Conn等[20]在研究哺乳動物接受TGF-β治療時發現，上皮-間質細胞轉化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)的過程會影響到百余種circRNAs的表達。由此看來，與傳統mRNA不同，circRNAs在不同細胞、組織中表達各異，并隨著機體發育及各項病理生理過程的改變而發生顯著變化。

5.其他。大部分circRNAs包含外顯子序列，多定位于細胞質，作為ncRNA的一種，其擁有miRNA反應元件(miRNA response elements，MREs)[3-4]，可作為“miRNA海綿”來發揮作用；而定位于真核生物胞核的ciRNA和EIciRNA則可能參與基因表達的調節，如敲除CircEIF3J可導致EIF3J水平的顯著下降[8，10]。

三、CircRNAs的獨特功能

盡管對于circRNAs發揮作用的確切機制仍不明確，但最近各類研究提示其可能通過與RNA和蛋白質作用，或調節基因轉錄及可變剪接、甚至參與翻譯等過程有關。

1.作為競爭性內源RNA(Competitive endogenous RNA，ceRNA)，即“miRNA海綿”小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as)，亦稱CiRS-7(Circular RNA Sponge for miR-7)擁有63個與miRNA-7相結合的保守位點[3，28]。CDR1as在細胞質中高表達，據估計在腦組織中，每個細胞最多可與20 000個miR-7分子相結合[29]。研究發現，抑制CDR1as的表達會導致miR-7靶向mRNA表達的減少，由此看來CDR1as可與mRNA競爭性相結合miR-7而在多項生命活動中發揮作用。此外，在小鼠體內，人們發現一種睪丸特異性circRNAs——CircSry，包含與miR-138靶向結合的16個特異位點[28]；CircHIPK3和Circ-Foxo3甚至能與多種miRNA相結合[30-31]。Lyu等[29]認為，盡管目前缺乏充分證據，circRNAs還可能與mRNA或lncRNA相結合來調節基因表達。

2.調節轉錄及可變剪接：circRNAs多定位于細胞質中，但在胞核中也發現有同時包含外顯子和內含子的EIciRNA的豐富表達，其被認為與親本基因的轉錄密切相關[10]。EIciRNA可通過特異的RNA-RNA相互作用的方式與U1小核核糖核蛋白(Small nuclear ribonucleoproteins，snRNP)結合形成EIciRNA-U1snRNP復合體，進而與RNA pol Ⅱ轉錄復合物作用以促進親本基因的轉錄。由于circRNAs與mRNA擁有共同的pre-mRNA起源，circRNAs的產生勢必會影響mRNA的剪接形成。如Ashwal-Fluss等[19]的研究發現，muscleblind基因可編碼剪接因子MBL，而CircMbl由能與傳統剪接(Canonical splicing)相競爭的剪接因子MBL第二個外顯子形成，其本身及側翼內含子序列擁有多個能與MBL緊密、特異結合的保守位點，因而MBL的水平會直接影響CircMbl的生物合成。

3.與某些蛋白質相互作用:研究發現，circRNAs可與Argonaute、RNA Pol Ⅱ和MBL等多種RBPs相結合，其可能通過類似于“miRNA海綿”的競爭模式來調節RBPs的功能以發揮重要作用。Foxo3是轉錄因子“叉頭家族”中的一員，由其來源的Circ-Foxo3可與抗衰蛋白ID1、E2F1以及抗應激蛋白FAK、HIF1α相結合而阻斷相應蛋白的生理作用[32]。Du等[33]的研究發現，Circ-Foxo3在非癌細胞中高表達，與細胞周期的進展相關，沉默內源性的Circ-Foxo3可促進細胞的增殖；進一步研究表明，異位表達的Circ-Foxo3可與細胞周期蛋白——周期依賴性激2(Cyclin-dependent kinase 2，CDK2)以及周期依賴性激酶抑制因子1(p21)相結合，形成Circ-Foxo3-p21-CDK2三體復合物而阻礙CDK2發揮作用，最終導致細胞周期受到抑制。但目前對于在無特定RNA結合域的情況下，Circ-Foxo3如何與這些蛋白質直接作用仍不十分清楚[29]。

4.參與翻譯過程：傳統觀點認為，circRNAs作為ncRNA家族中的一員，不參與核糖體介導的翻譯過程。但大部分circRNAs通常含有編碼蛋白質的外顯子和開放閱讀框[24，34](Open-reading frame，ORF)，而且多項實驗表明，人工改建的含有內部核糖體進入位點(Internal ribosome entry sites，IRES)或原核結合位點(prokaryotic binding site)的circRNAs可被有效翻譯[16，35]；最新研究甚至發現，在人類基因組中存在上千種不依賴5’帽端結構的翻譯序列[36]，Abe等[37]則通過實驗證明，哺乳動物或人類細胞中的circRNAs可不依賴任何IRES、poly A尾或是帽子結構而以滾環擴增(Rolling circle amplification，RCA)的方式翻譯出足量的蛋白產物。這些結果均提示，circRNAs可能以某種潛在機制有效地參與翻譯過程。

四、circRNAs與女性生殖和妊娠相關疾病

1.circRNAs在顆粒細胞中的表達：顆粒細胞對卵母細胞的發育、成熟起著重要的營養及信號轉導作用，對其基因表達改變的研究可對卵母細胞發育微環境進行重要評估，在輔助生殖技術中具有顯著意義。Cheng等[38]對不同年齡組IVF患者顆粒細胞circRNAs表達進行研究，發現circRNA_103829、circRNA_103827和circRNA_104816在高齡組(≥38歲)表達上調，而circRNA_101889明顯下調，接受促性腺激素治療調整后，則只有circRNA_103827和circRNA_104816的水平呈現出年齡正相關性；同時，二者還與高質量胚胎數存在負相關性。生物信息學分析提示，這兩種circRNAs可能通過circRNAs-miRNA-mRNA網絡調節共同的靶基因ANKRD20A9O、KCNQ1OT1和XIST來潛在地參與糖代謝、有絲分裂細胞周期和卵巢類固醇合成等重要過程：全基因組關聯分析顯示ANKRD20A9O位點與漢族人群壽命聯系密切[39]；KCNQ1OT1是父系表達的等位基因，通過調節組蛋白甲基化來參與轉錄沉默，如果發生誤調將引起嚴重生理和遺傳異常[40]；缺乏XIST會導致早囊胚期全基因組的轉錄水平誤調和植入后致死[41]。在卵巢衰老和胚胎異常發育的過程中，上述表觀遺傳學的調節異常起到了重要作用。

2.circRNAs與胚胎發育：哺乳動物的發育始于精卵結合形成受精卵，此時合子的基因轉錄開始被激活，分析不同階段基因的動態表達對于闡明早期胚胎發育的分子機制十分重要。在對輔助生殖技術植入前胚胎的研究中，Dang等[42]運用其團隊開發的單細胞RNA測序技術SUPeR-seq完成了單胚胎全轉錄組的分析，10 032種宿主基因來源的ecircRNAs被確認；進一步分析表明，2 974種circRNAs宿主基因中有1 554種是母源性基因，851種是合子基因。而不同發育階段(卵母細胞、合子、2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑葚胚和囊胚期)的表達水平差異則顯示，circRNAs在胚胎發育過程中的表達呈現出顯著的動態變化：其表達總量在28 774-190 008拷貝之間，4-細胞期達到峰值，而后逐漸下降，至孵化期囊胚最低；在宿主基因轉錄物占比中，桑葚胚期最高，可達25%；環狀與線性轉錄物之比(circular to linear ratio，CLR)在母源和合子基因之間也存在差異，母源基因CLR隨胚胎發育逐漸增加，尤其在8-細胞期之后，而合子基因CLR通常會下降。這些結果表明，在母源-合子轉化(maternal zygotic transition，MZT)過程中，circRNAs比其他線性轉錄物更能耐受母源性RNA的清除。與前期研究[43]相對比，Dang等還發現，小鼠植入前胚胎中確認的1 316種circRNAs宿主基因有835種(63%)也可產生人胚胎circRNAs；盡管確切作用機制尚未完全闡明，但基因本體論(Gene Ontology，GO)分析提示，circRNAs宿主基因在人胚胎中豐富存在，與DNA損傷修復、細胞器和染色體結構、細胞周期進程及代謝調節等過程息息相關。

3.circRNAs與卵巢上皮性腫瘤：腫瘤的發生通常由介導細胞增殖與分化的信號通路的調節異常所引起，如上皮-間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的NFkB，TGF-β和ILK，以及增殖信號通路中的PI3k/AKT，JAK/STAT等。通過對卵巢上皮性腫瘤組織樣本進行末端配對RNA測序，Ahmed等[44]研究證實了其中存在豐富表達的circRNAs，且相比于mRNA，circRNAs在不同腫瘤類別(原發灶、腹腔轉移部位以及轉移淋巴結)中的表達更具差異性，上述致瘤信號通路中高表達mRNA時均伴有相應的circRNAs表達下調；進一步研究發現，具有負性調節原癌基因RAS和MYC的miRNA let-7在原發灶中的表達明顯低于腹腔轉移部位，而相應的能夠編碼含有多個let-7結合位點的circRNAs的基因在卵巢腫瘤原發部位的表達是增高的，這或許可以用circRNAs作為miRNA海綿的獨特特性來合理解釋。

4.circRNAs與子癇前期：Zhang 等[45]首次嘗試檢測不同早孕(<20周)孕婦血細胞中circRNAs的表達差異，并聯合血漿蛋白因子Endoglin(ENG)來預測子癇前期(Preeclampsia，PE)的發生，結果顯示，血細胞circ_101222 表達在PE與正常孕婦間具有顯著差異。聯合血漿ENG檢測對PE的預測敏感性可達0.7073，特異性0.8049。Qian 等[46]比較了PE與早產產婦胎盤組織中circRNAs 的表達水平，發現hsa_circRNA_100782、hsa_circRNA_102682、hsa_circRNA_104820在兩組間有顯著差異，三者在PE組表達明顯上調。在此之前，欒麗霞等[47]則已通過實驗證實，與正常產婦相比，子癇前期患者胎盤組織中顯著高表達miR-30a-3p。這或許也暗示，miRNAs與circRNAs等構成的復雜ceRNA網絡對于促進PE的發生起到了重要作用。

五、總結與展望

高通量測序技術的飛速發展以及生物信息技術的日臻完善為我們進一步研究circRNAs提供了極大的便利，人體組織細胞內越來越多差異表達的circRNAs被檢測出來。然而，盡管現階段各類研究發現的circRNAs數目巨大，但對于其中的大部分，我們并不十分清楚其確切的作用機制及潛在功能。未來對于顆粒細胞及輔助生殖技術植入前胚胎表達的circRNAs的深入研究，有望更加全面、準確地解讀或評估生殖細胞及胚胎的發育過程，為實現優生優育打下堅實的理論基礎。由于具有較高的穩定性，現已在人唾液、外泌體和血樣本中檢測到circRNAs的存在，因而有理由相信，circRNAs在作為診斷卵巢癌和子癇前期等女性生殖相關疾病的生物標志物以及用以評價個體易感性等方面的應用具有光明前景。鑒于circRNAs的獨特功能，我們甚至可以通過構建外源人工circRNAs，利用其與miRNA和RBPs等的密切聯系來調節目的基因的表達，進而調控配子形成和胚胎發育以及對各類疾病起到良好的治療效果。總而言之，circRNAs的發現為我們更好解讀微觀世界的基因表達調控網絡打開了一扇嶄新的大門，為維護女性生殖健康提供了更為廣闊的思路。

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