污水中抗生素抗性菌及抗性基因的去除技術

陳蕾，George (Zhi) ZHOU

1. 南京林業大學土木工程學院，江蘇 南京 210037；2. 美國普渡大學土木工程學院，美國 印第安納州 47906

抗生素自被發現以來被廣泛應用于人類醫療及畜禽與水產養殖業，給人類帶來了諸多益處。然而，因濫用抗生素導致的抗性細菌（ARB）及抗性基因（ARG）污染正威脅著人類健康與生態安全，已引起全球的高度關注。據估算，每年因抗生素抗性菌引起的死亡人數在美國至少達23000人，歐洲將近25000人，而欠發達國家則更多（Vikesland et al.，2017）。細菌通過自身突變或抗性基因的水平轉移等途徑獲得抗性基因，進而通過改變藥物作用靶位、主動外排藥物、產生抗菌藥物鈍化或滅活酶、改變孔蛋白阻止抗生素滲透或改變藥物代謝途徑等機制對抗生素產生抗性（Bengtsson-Palme et al.，2018）。抗性菌中攜帶抗性基因的質粒、轉座子、整合子等載體又能通過基因的轉化、轉導、接合和轉座等方式在環境中進行傳播擴散，即使抗性菌死亡，其攜帶抗性基因的裸露DNA也會在環境中長期存在（Davies，1994）。雖然細菌在自然條件下就能產生抗生素抗性基因，但是持久性存在的低濃度抗生素對細菌產生選擇壓力，使被抗生素污染的環境介質中抗性菌及抗性基因的水平遠遠高于環境背景值（Bengtsson-Palme et al.，2018）。目前，中國及其他國家的養殖場廢水、醫療廢水、污水處理廠各級出水、地表水、底泥、土壤及大氣中均檢測到了抗生素抗性菌和抗性基因的污染（Storteboom et al.，2010；Guo et al.，2014；Czekalski et al.，2015；Li et al.，2015；沈怡雯等，2015；Bougnom et al.，2017）。城鎮污水處理系統匯集了居民生活、工業生產、農業生產、醫療衛生等各方面的廢水，將多種類型的抗性基因混合、轉移和傳播，使抗性基因在污水和污泥中廣泛分布，最后通過出水及污泥排放到受納環境中，造成環境污染（Korzeniewska et al.，2013；Lee et al.，2017）。

城鎮污水是抗性菌和抗性基因重要的“匯”和“源”，因此污水中抗性菌和抗性基因的高效去除是控制環境中抗性基因污染與傳播的重要措施。本文綜述了近幾年生物處理工藝、消毒工藝及高級氧化處理技術等去除污水中抗性菌及抗性基因的研究進展，并對未來的研究方向提出建議，為完善污水廠現有的處理工藝以及研發高效的抗性菌及抗性基因的去除技術提供一定的思路。

1 生物處理法對ARB和ARG的去除

1.1 活性污泥及相關工藝

活性污泥及相關工藝是城市污水廠最常用的處理系統。研究表明，活性污泥工藝對進水中的抗性菌和抗性基因有顯著的削減作用。Zhang et al.（2009a）研究了中國和美國五大城市的活性污泥工藝對四環素抗性基因的去除，發現出水中的四環素抗性基因tetC和tetA均比進水降低了3個數量級。B?rjesson et al.（2010）研究發現，傳統活性污泥工藝可使污水中的四環素抗性基因 tetA濃度減少0.4～1.5 log單位，tetB減少0.5～1.6 log單位。Gao et al.（2012）也發現經活性污泥工藝處理后出水中的四環素和磺胺類抗生素的抗性菌及抗性基因濃度顯著降低。但是，這些減少的抗性菌和抗性基因主要被污泥吸附，并未得到真正地去除，會隨著污泥的再利用而進入土壤環境，威脅人類健康（B?rjesson et al.，2009）。因此，活性污泥工藝中污泥的后續處理非常重要，其中高溫厭氧條件下的污泥消化對抗性菌和抗性基因具有明顯的去除作用（Diehl et al.，2010）。

活性污泥相關工藝，如缺氧/好氧工藝（A/O）、厭氧/缺氧/好氧工藝（A2/O）及序批式活性污泥反應器（SBR）等，因其增加了污水與污泥的有效接觸而取得了較好的處理效果，被廣泛應用于城市污水處理。但是污水停留時間的延長有利于細菌的變異與增殖，加速抗性基因的水平轉移，造成出水中抗性基因的種類顯著增加。如Zhang et al.（2009b）研究發現A/O處理工藝的出水中，不動桿菌對多種抗生素的抗性比進水增加 10%左右。此外在 A2/O工藝中也出現大腸桿菌和腸球菌對抗生素的抗性增強的現象（?uczkiewicz et al.，2010）。Fan et al.（2011）發現序批式活性污泥反應器（SBR）中微量的紅霉素對細菌產生選擇壓力，促進抗性基因的形成與傳播，出水中檢測到了進水中未檢測到的紅霉素抗性基因。

可見，雖然活性污泥及相關工藝對污水中抗性菌和抗性基因有一定的去除效果，但是去除率不高，且生化池中高的抗生素濃度和高的微生物量加快了抗性基因的傳播，導致二級出水中依然含有較高濃度的抗性菌和抗性基因。此外，富集了抗性菌和抗性基因的污泥可能成為二次污染源，也需要進一步處理。

1.2 膜生物處理工藝

膜生物處理工藝在城市污水的處理中也有廣泛的應用。B?rjesson et al.（2010）對比了活性污泥工藝和滴濾池對四環素抗性基因的去除，發現后者的處理效果更好。由于膜生物處理工藝中的微生物附著在載體上生長，殘留在出水中的生物質含量較少，因此出水中的抗性菌和抗性基因比活性污泥工藝更低。Novo et al.（2010）則對比了淹沒式的曝氣生物濾池和滴濾池對抗性菌的去除，發現曝氣生物濾池能使抗性菌的數量降低 2個數量級，而滴濾池的去除率低于 50%，并指出生物處理工藝、水力停留時間及進水水量等是影響膜生物處理去除抗性菌效果的重要因素。Munir et al.（2011）對比研究了膜生物反應器（MBR）、活性污泥工藝、氧化溝工藝、旋轉式生物接觸反應器等對四環素類和磺胺類的抗性菌和抗性基因的去除效果，發現MBR對抗性菌和抗性基因的去除率達到2.57～7.06 log單位，明顯優于其他工藝（2.37～4.56 log單位），并認為不同處理工藝之間的差異是由環境中的多重選擇壓力造成的。Sui et al.（2018）構建了序批式膜生物反應器（SMBR）來去除養豬廢水中的抗性基因，發現當固體停留時間較長時（30 d），膜的分離作用明顯，ARG的去除率達1.18個log單位；在固體停留時間較短時（12 d），生物處理占主導作用，ARG的去除率最大，為2.91個log單位。Zhu et al.（2018）研究了 MBR反應器中膜污垢在抗性基因去除過程中的作用，發現膜污垢中的可溶性微生物產物（SMP）及其胞外多聚物（EPS）的含量與抗性基因的豐度顯著相關，說明膜污垢在MBR反應器去除抗性基因的過程中發揮著重要的作用。在膜生物處理工藝中，水中的抗性菌和抗性基因是通過富集到生物膜中而得以去除，因此跟活性污泥類似，膜生物處理工藝如滴濾池的生物膜中同樣富集了大量的抗性菌和抗性基因，若后續沒有得到有效處理，將會成為環境中抗性菌和抗性基因的二次污染源（Petrovich et al.，2018）。

通常膜生物處理工藝對水中抗性菌和抗性基因的去除效果普遍高于活性污泥工藝；此外污水停留時間短，污泥量少，造成二次污染的風險也比活性污泥工藝低。

1.3 人工濕地處理系統

人工濕地由于其工藝簡單、成本低及高效等優點而被廣泛應用于人口較少的城鎮或農村生活污水的處理。人工濕地不僅對污水中的有機物、氮磷、抗生素、藥物等均具有較好的處理效果，對抗性基因也具有一定的去除效果（鄭加玉，2013；Sharma et al.，2016）。Chen et al.（2013）發現人工濕地能有效地去除城市污水中四環素和磺胺類的抗性基因，在厭氧生物過濾后加設人工濕地處理系統可以使農村生活污水中四環素和磺胺類的抗性基因的去除量提高2個數量級。Liu et al.（2013，2014）研究發現，自由表面流人工濕地出水中的四環素和磺胺類的抗性基因水平明顯低于進水，而垂直潛流人工濕地及水平潛流人工濕地對抗性基因的去除效果不明顯，因此提出表層水中的氧化作用是抗性基因被去除的主要機理。然而，Huang et al.（2015）研究則表明，垂直上升流的人工濕地對養豬廢水中的四環素抗性基因的去除率達45%～99%。此外，垂直流人工濕地的填料對抗性基因的去除也有顯著的影響。Liu et al.（2013）研究指出，以沸石作為填料的垂直流人工濕地對抗性基因的去除效果比以火山巖作為填料的垂直流人工濕地好，更小的填料粒徑有利于抗性基因的去除，因此填料對抗性基因的吸附也是其去除抗性基因的機制之一。然而，楊芳等（2013）在研究不同類型的人工濕地去除抗性大腸桿菌及抗性基因中發現水中的抗性基因轉移到了基質生物膜上，隨著生物膜的脫落，出水中的抗性基因的含量依然較高。He et al.（2018）研究比較了不同類型的人工濕地對污水廠二級出水中抗性菌和抗性基因的去除作用，發現所有類型的人工濕地出水中抗性菌的數量均顯著增加，原因是細菌出現再生長；垂直潛流人工濕地和其中的一種表面流人工濕地對抗性基因有顯著的去除作用，去除率分別為14%～95%以及57%～100%，而另外一種表面流人工濕地出水中抗性基因的濃度反而增加，其原因可能是污水中低濃度的抗生素、重金屬等對抗性菌產生了選擇壓力，促進了抗性基因的傳播，此外人工濕地適宜的條件有利于微生物的再生長。

可見，人工濕地處理系統對抗性菌和抗性基因的去除效果與濕地的類型、植物種類、水力負荷及填料種類等有關，在實際應用中，需針對污水的性質設計相應的人工濕地處理系統。

2 消毒工藝對ARB和ARG的去除

2.1 氯消毒工藝

隨著城市污水廠出水要求的提高，二級出水之后加設消毒環節越來越普遍。氯消毒是最普遍的水和廢水的消毒工藝。氯消毒產生的次氯酸具有強氧化性，能迅速氧化細胞成分，包括核堿基的嘌呤和嘧啶基團等，其中與游離性的堿基反應性很強，但因氫鍵的原因與雙鏈DNA的反應活性較弱（Dodd，2012）。

采用氯消毒去除抗性基因的過程中，次氯酸首先氧化細胞壁，然后進入細胞內部與 DNA反應，因此只有較高的加氯量才能保證次氯酸進入到細胞內與 DNA反應，而污水廠常規氯消毒劑量通常難以有效去除抗性基因（Munir et al.，2011；Gao et al.，2012）。Huang et al.（2011）采用 10 mg·L-1（Cl2）的次氯酸鈉對二沉池出水進行消毒，接觸時間10 min，發現青霉素、氨芐西林、四環素和利福平的抗性菌減少了4個數量級，但是對氯霉素抗性菌無明顯去除效果。Yuan et al.（2015）研究了氯消毒對污水中9種抗生素抗性菌和抗性基因的去除作用，加氯量范圍為 15～300 mg·min·L-1，發現除磺胺嘧啶和紅霉素的抗性菌之外的其他抗性菌都能被15 mg·min·L-1的氯完全滅活，而磺胺嘧啶和紅霉素的抗性菌需要施加大于60 mg·min·L-1的氯才能被完全滅活；最高劑量的氯消毒對紅霉素抗性基因和四環素抗性基因的去除率僅為60%和20%。Zhang et al.（2015）研究表明，氯消毒對抗性基因的去除效果跟加氯劑量和接觸時間密切相關，加氯量越大，接觸時間越長，抗性基因的去除率越高；施加 30 mg·min·L-1的氯可去除1.3～1.49 log單位的磺胺類和四環素抗性基因；溶液中的銨態氮則對抗性基因的去除產生明顯的抑制作用。然而，Huang et al.（2011）研究則指出，氯消毒雖然可以有效去除抗性菌，但是殘留的微生物群落發生了很大的變化，其中抗氯霉素、氨芐西林和青霉素的菌比例增加。Shi et al.（2013）研究也發現，經氯消毒后的飲用水中四環素、紅霉素等數種抗性基因的比例增加。可見，氯消毒很可能對微生物產生選擇壓力，從而加速了抗性基因的傳播，增加了出水的環境風險。

2.2 紫外消毒工藝

紫外消毒（UV）的原理是細菌的RNA和DNA結構被所吸收的紫外線光能破壞。采用UV去除抗性基因的過程中，紫外光直接破壞細胞內攜帶抗性基因的DNA片段，而對細胞其他組分不產生影響（Guo et al.，2015）。Auerbach et al.（2007）和 Lee et al.（2017）研究均表明，污水處理廠的常規紫外消毒劑量對四環素類、磺胺類、紅霉素類等多種抗性基因均無明顯的去除效果。Mckinney et al.（2009）發現紫外消毒可以去除1個數量級的甲氧西林抗性基因，但是對萬可霉素抗性基因無明顯去除效果。通常紫外輻射的強度越大，抗性基因的去除效率也越高（Zhang et al.，2015）。Mckinney et al.（2012）采用紫外消毒處理mecA、vanA、tetA和ampC 4種抗性基因，發現 10～20 mJ·cm-2的紫外劑量能滅活4～5個數量級的抗性菌，而高達 200～400 mJ·cm-2的紫外劑量僅能去除3～4個數量級的抗性基因；且革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對紫外消毒有更強的耐受性。Chang et al.（2017）采用紫外消毒工藝對含有氨芐西林和四環素抗性基因的質粒進行降解研究，發現轉導效率每降低一個log單位，紫外輻照的劑量需增加20～25 mJ·cm-2。可見，采用紫外消毒工藝有效去除抗性基因需要很高的紫外輻照劑量，遠遠超出常規的紫外消毒劑量。

2.3 臭氧消毒工藝

臭氧消毒的原理是利用臭氧及臭氧分解產生的羥基自由基（·OH）的強氧化性破壞細胞的結構。臭氧與細胞壁和細胞膜的肽聚糖、蛋白質及脂類具有很強的反應性，所以除非施加較高的濃度，通常臭氧難以滲透到細胞內與DNA反應（Dodd，2012）。與次氯酸相似，臭氧與游離性的堿基反應活性較高，但是與雙鏈DNA的反應活性則較低（Somensi et al.，2015）。

臭氧及其分解產生的羥基自由基首先氧化破壞細胞壁組分，然后滲入細胞內部，氧化降解攜帶抗性基因的DNA片段，因此有效去除抗性基因所需的臭氧劑量比常規消毒劑量高（Oh et al.，2016）。?ncü et al.（2011）發現臭氧能有效去除含抗性基因的質粒，0.9 mg·L-1的臭氧就能使質粒的雙螺旋結構解開，當臭氧劑量為4.2 mg·L-1時，質粒DNA濃度最低。Oh et al.（2016）研究發現，臭氧消毒可使含抗性基因的質粒的轉導性能降低1個數量級，同時加入過氧化氫或過硫酸鹽可以顯著提高去除效率。Czekalaki et al.（2016）從實驗室和工程應用角度分別研究了臭氧消毒對污水中磺胺類sul1抗性菌和抗性基因的去除作用，實驗室的研究指出預絮凝和高的臭氧濃度（O3與DOC濃度比大于 0.55）均有利于抗性菌和胞內抗性基因的有效去除，而污水廠的工程實踐研究則表明雖然臭氧消毒能殺滅抗性菌，但是部分滅活的抗性菌之后會復活，且臭氧消毒對胞內抗性基因沒有顯著的去除效果。

2.4 納米顆粒殺菌技術

采用納米顆粒去除抗性菌和抗性基因的研究主要集中在醫藥研究領域。金屬氧化物納米顆粒如納米氧化銀、納米氧化銅等均具有一定的殺菌作用，其原理主要是具有高比表面積的納米粒子對細菌細胞內的酶、蛋白質等生物分子產生強吸附作用，破壞生物大分子的生理功能從而達到殺菌的效果（Huang et al.，2014）。有研究表明，納米氧化鐵可以滅活抗性生物膜（Taylor et al.，2012）。納米金顆粒與萬古霉素聯用可以殺滅萬古霉素抗性菌（Mohammed et al.，2011）。然而，納米顆粒也會對細菌產生選擇壓力而促進抗性基因的傳播，如納米鋁顆粒可以使含多種抗生素抗性基因的質粒的水平轉移效率提高200倍（Qiu et al.，2012）。因此，在水處理中采用納米顆粒殺菌技術存在增加抗性基因傳播的風險。

2.5 不同消毒工藝間的比較

不少研究者對比了常見的幾種消毒工藝對抗性菌和抗性基因的去除效果。在對抗性菌的去除方面，Macauley et al.（2006）比較了氯消毒、紫外消毒和臭氧消毒對養豬廢水中的金霉素、林可霉素、磺胺甲嘧啶和四環素的抗性細菌的去除效果，發現UV消毒＞臭氧消毒＞氯消毒；然而 Zheng et al.（2017）研究則發現，臭氧消毒在殺滅抗性菌方面是最高效的。在對抗性基因的去除方面，Zhuang et al.（2015）和Zhang et al.（2015）對比了常見的幾種消毒工藝對磺胺類和四環素類抗性基因的去除效果，發現單工藝中氯消毒是去除抗性基因最高效的手段，且經濟成本最低；當紫外和氯聯合消毒時則能進一步提高抗性基因的去除率。此外，在影響抗性基因的水平轉移風險方面，Guo et al.（2015）對比研究了紫外消毒和氯消毒對抗性基因的水平轉移的影響，發現低劑量的紫外消毒（8 mJ·cm-2）直接破壞DNA，降低了細菌的數量，而沒有改變細菌細胞的滲透性，因此對抗性基因的水平轉導沒有影響，高劑量的紫外消毒（＞10 mJ·cm-2）則能提高抗性基因的水平轉移的風險；而即使低劑量的氯消毒（40 mg·min·L-1）則能使抗性基因的轉移幾率提高2～5倍，且加氯濃度越高，轉移幾率越大；此外氯消毒過程中產生的氯胺會增強細胞的滲透性，進一步提高抗性基因轉移的風險。

因此，不同的消毒方式對抗性菌和抗性基因的去除效果與抗性基因的種類、消毒劑量、水質等密切相關，實際應用中需要綜合考慮抗性基因的去除效果、處理成本及抗性基因的轉移風險等因素。從抗性基因的去除和轉移風險來看，紫外消毒優于氯消毒和臭氧消毒。

3 高級氧化技術對ARB和ARG的去除

近年來有不少研究者開始將高級氧化技術應用于污水中抗性細菌和抗性基因的去除，且獲得了非常高的去除效率。高級氧化技術對抗性基因的去除主要歸因于體系中產生的羥基自由基對抗性基因的氧化破壞（Pham et al.，2014）。Karaolia et al.（2014）研究發現，太陽光Fenton體系可以使抗磺胺磺胺甲惡唑和克拉霉素的腸球菌減少5 log單位。Fiorentino et al.（2015）對比了太陽光/H2O2、太陽光/TiO2、太陽光/H2O2/TiO2和太陽光Fenton對多種抗生素抗性菌的滅活作用，發現太陽光/TiO2和太陽光Fenton的滅活效果最佳。Zhang et al.（2016）采用Fenton和UV/H2O2技術處理污水廠的二級出水，發現兩者均對污水中磺胺類和四環素類抗性基因有顯著的去除作用，在最佳的配比條件下，去除效果分別達2.26～3.35 log單位和1.55～2.32 log單位。Yoon et al.（2017）研究發現UV/H2O2對胞外抗性基因（質粒）有很好的去除效果，但是對胞內抗性基因的去除效果一般。Guo et al.（2017）發現UV/TiO2對mecA和ampC兩種抗生素的抗性菌和胞內及胞外抗性基因均有顯著的去除作用，其基因的長度越長，對UV的耐性也越強；H2O2的加入會進一步促進抗性基因的降解，其原因是增加了羥基自由基的生成量。雖然與生物處理法和消毒工藝相比，高級氧化技術具有更高的去除效率和較低的基因轉移風險，但是處理成本相對較高，TiO2光催化工藝中TiO2的固定以及Fenton體系中污泥的產生等問題限制了其大范圍的工程應用。

此外，還有研究者提出微濾/超濾和混凝處理有助于污水中抗性基因的去除，將其與污水廠原有的工藝相結合有望降低出水中的抗性基因水平（Breazeal et al.，2013；Li et al.，2017）。

4 結論與展望

城鎮污水中抗生素抗性菌和抗性基因的去除效率是控制環境中抗性基因污染與傳播的關鍵因素。生物處理是常規城市污水處理流程中抗性菌和抗性基因去除的主要環節，而污泥的后續處理是避免二次污染的重要措施。消毒工藝對抗生素抗性基因的去除具有選擇性，且通常需要很高的消毒劑量才能達到有效的去除。生物處理和消毒工藝都會加速抗性基因的傳播，而高級氧化處理技術不僅去除效果好，且能有效控制抗性基因的傳播，因此利用高級氧化技術去除抗性菌和抗性基因將是今后發展與應用的重要方向。然而，將以上處理手段用于工程實踐時仍存在諸多問題，建議今后從以下幾方面開展研究：

（1）研究生物處理工藝中污泥的高效處置方法，盡量避免抗性基因的二次污染；同時深入研究水力、水質參數抗性基因水平轉移的影響與機制，通過調整運行參數盡量減少常規生物處理系統中抗性基因的傳播。

（2）深入研究消毒工藝中抗性基因種類、水質參數、消毒劑量等對抗性基因水平轉移的影響，開發低劑量的組合消毒工藝，在高效去除抗性基因的同時盡量減少抗性基因的傳播。

（3）研究 TiO2的固定化工藝，提高 TiO2的利用效率；同時研發電化學高級氧化、硫酸根自由基氧化等更高效、經濟的對抗性菌及抗性基因的控制技術。

（4）由于單工藝通常使用的劑量較大、成本較高、去除效果不理想且增加了抗性基因傳播的風險，今后應針對多工藝的聯合處理技術開展深入的研究。