蔬菜單倍體離體誘導及其在遺傳育種中的應用

劉冰江 霍雨猛 楊妍妍 吳雄

摘要：單倍體誘導技術對改良蔬菜品種、加速品種選育進程具有重要意義。本文就蔬菜單倍體離體誘導的主要途徑、影響因素、染色體加倍技術及其在遺傳育種中應用的研究進展進行了綜述和討論，分析了蔬菜單倍體研究中存在的問題，并對其應用前景進行了展望。

關鍵詞：蔬菜單倍體；離體雄核發(fā)育；離體雌核發(fā)育；雙單倍體；遺傳育種

中圖分類號：S603.6-1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）02-0151-07

Abstract Haploid induction technology is important for vegetable variety improvement and accelerating breeding process. In this article， we summarized the vegetable haploid induction in vitro from the main induction pathway， affecting factors， chromosome doubling technique and its application in genetic breeding. The existing problems and application prospect were analyzed， too.

Keywords Vegetable haploid； In vitro androgenesis； In vitro gynogenesis； Double haploid； Genetic breeding

單倍體是指具有配子體染色體組成的孢子體。在高等植物生長發(fā)育過程中，正常的單倍體世代（配子體世代）非常短，從受精后到發(fā)育至成熟植株都是二倍體世代（孢子體世代）。通過離體誘導途徑產生的單倍體可以加倍獲得純合的雙單倍體，而雙單倍體可作為育種過程中的中間材料或親本育成雜交種。由于單倍體技術能夠快速、高效地純化育種材料，在蔬菜品種改良、加速品種選育進程方面具有重要意義，因此越來越受到育種家的重視。蔬菜作物自然產生單倍體的頻率極低，主要通過離體誘導的方法獲得單倍體。目前已經有十幾種蔬菜作物應用了單倍體育種技術，其中包括蕓薹屬、瓜類、辣椒、茄子、洋蔥等。利用單倍體技術選育新品種已經成為蔬菜作物育種的重要方法[1]。

1 蔬菜離體單倍體誘導的主要途徑

蔬菜離體單倍體主要通過離體雄核發(fā)育（in vitro androgenesis）和離體雌核發(fā)育（in vitro gynogenesis）兩種誘導途徑獲得。離體雄核發(fā)育是指在特定離體培養(yǎng)條件下，通過對植物花藥或花粉（游離小孢子）進行誘導處理，促使小孢子離開原來的配子體發(fā)育途徑向孢子體發(fā)育途徑轉變，形成胚狀體，從而獲得單倍體的過程[2]。離體雌核發(fā)育是指通過離體培養(yǎng)未受精胚珠、未授粉子房或整個花蕾，使大孢子或雌配子體向孢子體途徑轉變誘導產生單倍體或雙單倍體的過程。

Lichter（1982）[3]首次通過培養(yǎng)甘藍型油菜游離小孢子，成功獲得了單倍體再生植株。游離小孢子培養(yǎng)的主要優(yōu)點是獲得的再生植株單倍體及雙單倍體率較高，避免了花藥培養(yǎng)中可能的二倍體體細胞胚的再生，已經在十字花科、茄科和葫蘆科等蔬菜中應用。

通過雌配子體誘導蔬菜單倍體研究可追溯到20世紀70年代。Uchiyama等（1971）[4]通過培養(yǎng)茄子未受精的胚珠誘導出了愈傷組織，并且觀察到單倍體細胞分裂，但是沒有獲得單倍體再生植株。后來，許多研究者通過離體培養(yǎng)未受精胚珠、子房、花蕾得到單倍體，證明雌配子體的不正常發(fā)育形成愈傷組織或胚性組織，誘導了單倍體的產生[5]。

2 影響蔬菜單倍體離體誘導的因素

2.1 供體植株的基因型

無論是通過離體雄核還是雌核發(fā)育途徑誘導單倍體，供體植株的基因型都是影響誘導率的重要因素之一。不僅不同蔬菜種類之間的誘導能力存在差異，同一種蔬菜不同品種之間的誘導率也存在明顯差別。

基因型在甘藍小孢子胚狀體誘導中起著主導作用[6]。方淑桂等（2006）[7]用結球甘藍胚狀體誘導率高的材料與不易誘導胚狀體的材料進行雜交，能明顯提高不易誘導胚狀體材料的出胚率；雙交種與單交種相比更容易誘導出健壯的胚狀體。在相同的離體雄核發(fā)育條件下，不同基因型辣椒的單倍體誘導率存在很大差異[8，9]。Zagorska等（1998）[10]發(fā)現85份番茄基因型的離體雄核發(fā)育中，53份形成了愈傷組織，只有15份獲得了單倍體再生植株。莊飛云等（2010）[11]研究發(fā)現39份胡蘿卜材料中只有6份形成了小孢子胚狀體。

Bohanec和Jake（1999）[12]利用源自歐洲、美國和日本的39個洋蔥育種材料的未授粉花蕾進行離體培養(yǎng)，單倍體誘導率最高的是源自美國的1個品種，美國的洋蔥材料的單倍體平均誘導率分別是歐洲和日本的5倍和9倍。通過培養(yǎng)不同基因型西葫蘆未受精胚珠獲得單倍體的胚誘導率從0～48.8%不等[13]，然而Chen等（2011）[14]利用同一種培養(yǎng)基對西葫蘆進行花藥培養(yǎng)卻獲得了較好的誘導效果，這表明同一基因型的雄核和雌核發(fā)育誘導能力存在較大差別。

2.2 配子體的發(fā)育時期

雌雄配子體的發(fā)育時期是單倍體誘導能否成功的重要內在因素。在辣椒小孢子培養(yǎng)時，選擇小孢子處于單核末期的花藥，單倍體誘導率最高[15，16]。西葫蘆小孢子單核中期和晚期的單倍體誘導效果較好[17]。番茄單核期的小孢子更適合單倍體誘導[18]。Gémes-Juhász等（2002）[19]進行黃瓜單倍體誘導培養(yǎng)時發(fā)現，雌花開放前6 h進行子房培養(yǎng)，胚的誘導率最高。謝冰等（2006）[20]對西葫蘆未受精胚珠進行離體培養(yǎng)的研究結果表明，成熟及接近成熟的胚囊對誘導條件比較敏感，而成熟后的胚囊成員細胞在離體條件下較難啟動分裂。Musial等（2005）[21]則認為發(fā)育早期（雙核期或四核期）的胚囊比含有成熟大孢子母細胞的胚囊或成熟的胚囊更適合單倍體誘導。

2.3 培養(yǎng)基組成

不同種類的蔬菜單倍體誘導需要的基本培養(yǎng)基不同。在瓜類、茄科蔬菜單倍體誘導培養(yǎng)中，大多數使用MS為基本培養(yǎng)基或是在其基礎上對某些成分進行少量修改[22-24]。王燁等（2015）[25]對黃瓜未受精胚珠進行誘導培養(yǎng)時發(fā)現，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量接近的培養(yǎng)基中胚的誘導率較高。十字花科蔬菜小孢子培養(yǎng)大多采用NLN、蔥蒜類蔬菜大多采用B5等基本培養(yǎng)基[26-31]。

培養(yǎng)基中的激素成分對于單倍體的誘導起著十分重要的作用。Kumar等（2003）[32]認為B5基本培養(yǎng)基中添加2.0 μmol/L 2，4-D和1.0 μmol/L BAP最適合黃瓜花藥胚性愈傷組織或胚的形成。黃瓜未受精子房或胚珠培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中加入0.04 mg/L TDZ（thidiazuron，苯基噻二唑脲），胚狀體的誘導率最高[33]。胡蘿卜未受精胚珠培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中加入IAA促進了胚狀體的形成，而加入2，4-D 和6-BA促進了愈傷組織的形成[34]。一般來說，激素水平偏低，難以誘導雌核發(fā)育；水平偏高，又易誘導體細胞的愈傷組織，抑制雌核發(fā)育。Martinez等（2000）[35]用多胺代替生長素和細胞分裂素促進了洋蔥單倍體的誘導。脯氨酸和甘氨酸對黃瓜離體雌核發(fā)育具有明顯的促進作用[18]。

培養(yǎng)基中的蔗糖濃度是影響單倍體誘導的另一個重要因素。蔗糖不僅是培養(yǎng)基中的一種碳源，還是一種滲透壓調節(jié)劑。朱守亮等（2009）[36]在對甘藍進行小孢子培養(yǎng)時發(fā)現，培養(yǎng)基中添加13%和15%的蔗糖時能夠誘導出胚狀體，而添加10%和17%的蔗糖時沒有誘導出胚狀體，說明蔗糖濃度過低或過高都不適于甘藍小孢子胚胎的發(fā)生。在對分蔥和普通洋蔥的種間雜交種進行未授粉花蕾誘導培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為7.5%時誘導效果較好[28]。培養(yǎng)基中較高的蔗糖濃度對大部分植物離體雌核發(fā)育是有利的，但在對西葫蘆的未受精胚珠進行離體培養(yǎng)時，30 g/L蔗糖的胚狀體誘導效果最好，過高的蔗糖濃度反而抑制胚狀體的誘導，濃度達到90 g/L時沒有產生胚狀體[12]。

2.4 溫度脅迫處理

植物單倍體培養(yǎng)時用適宜的溫度脅迫對材料進行預處理，可有效改變雌雄配子體的發(fā)育途徑，誘導發(fā)育狀態(tài)從配子體途徑進入孢子體途徑[13，37，38]。研究證實利用黃瓜胚珠和子房進行單倍體誘導培養(yǎng)時，先在35℃預處理3 d，單倍體胚的誘導率和植株再生率明顯提高[18，31]?；ㄒ诵℃咦釉?2.5℃下預培養(yǎng)處理1 d，顯著提高了胚狀體誘導率[39]。番茄花蕾在4℃低溫下預處理2 d，然后在10℃處理9 d，胚的誘導效果最佳[40]。而胡蘿卜花藥在4°C處理12 d，胚的誘導效果最佳[41]。

3 單倍體染色體加倍

3.1 自然加倍

從理論上講，小孢子只攜帶供體植株一半的染色體，由小孢子誘導培養(yǎng)產生的再生植株應該都是單倍體，但實際情況是再生植株中出現了不同比例的二倍體。研究發(fā)現，通過小孢子培養(yǎng)技術獲得的二倍體再生植株率在不同的蔬菜作物間存在明顯差異。如在甘藍型油菜中，小孢子再生植株的自然加倍率為10%～26%[42]；在大白菜小孢子培養(yǎng)再生植株中，多數基因型經自然加倍的二倍體植株可達50%以上[43]。白菜型油菜小孢子培養(yǎng)自然加倍的二倍體再生植株率超過70%[44]。芥菜單倍體誘導過程中，再生植株自然加倍率僅為4%～6%[45]。不同基因型胡蘿卜小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株自然加倍率范圍較廣，從5.6%～100%不等[46]。茄子小孢子培養(yǎng)再生植株的自然加倍率能達到60%[23]。雌核發(fā)育途徑誘導單倍體研究中同樣存在著自然加倍的現象。Kiekowska和Adamus（2010）[34]通過對胡蘿卜未受精胚珠進行離體誘導培養(yǎng)得到的再生植株中97.7%是二倍體，其中45.9%是純合的雙單倍體?？梢钥闯觯参飭伪扼w培養(yǎng)中廣泛存在著自發(fā)形成雙單倍體的現象?？赡苁峭ㄟ^核內重復復制或核融合導致了染色體的自然加倍[47]。

3.2 誘導染色體加倍

雖然單倍體誘導過程中普遍存在自然加倍，但大部分頻率較低，有必要利用有效措施進行人工染色體加倍。誘導單倍體染色體加倍的最常用化學藥劑是秋水仙素。作為一種微管抑制劑，秋水仙素能夠在適宜濃度下抑制紡錘絲形成，使分生細胞復制的染色體在細胞分裂時不能正常分向兩極，從而誘導染色體加倍。當在培養(yǎng)基中添加0.3%秋水仙素處理蘆筍單倍體7 d，得到了最好的誘導效果[48]。羽衣甘藍單倍體試管苗的加倍以秋水仙素濃度70 mg/L、處理時間9～11 d為宜[49]。張振超等（2013）[50]對3種甘藍類蔬菜誘導的單倍體植株采用200 mg/L秋水仙素浸根處理20 h，二倍體誘導率達到50%以上。Lim和Earle（2009）[51]用500 mg/L的秋水仙素處理甜瓜單倍體植株外植體節(jié)間12 h，加倍效果較好。Lotfi等（2003）[52]則用750 mg/L的秋水仙素處理甜瓜單倍體莖尖3 h，得到了較好的加倍效果。

秋水仙素與植物微管蛋白親和性較低，加倍時通常濃度在毫摩級。還有一些化學除草劑如甲基胺草磷、安磺靈和氟樂靈等在誘導染色體加倍時也具有很大的潛力，它們誘導染色體加倍的機理和秋水仙素相同，但與秋水仙素相比，這些藥劑與植物微管蛋白的親和性較強，所用濃度在微摩級時即具有相似的加倍效果，而且毒性更低，但目前發(fā)現僅在少量蔬菜種類的單倍體誘導加倍過程中有效。用安磺靈和氟樂靈處理甘藍單倍體的試驗結果表明，氟樂靈的加倍效果更好[53]。利用甲基胺草磷、安磺靈和氟樂靈三種藥劑在對洋蔥單倍體進行加倍時也取得了較好效果，所用劑量僅為50 μmol/L[54]。

4 單倍體在蔬菜遺傳育種研究中的應用

4.1 用于轉基因供體

單倍體胚及其再生植株等都可以作為轉基因受體進行遺傳轉化，且轉化后獲得的植株不存在基因顯隱性問題，可經加倍獲得純合的轉基因株系，并能穩(wěn)定遺傳。劉凡等（1998）[55]利用大白菜小孢子胚狀體為受體獲得了抗除草劑T0代植株。Tsukazaki等（2002）[56]利用甘藍雙單倍體材料的下胚軸作為受體，建立了穩(wěn)定的根癌農桿菌介導的轉化體系。Cogan等（2001）[57]利用青花菜、花椰菜、甘藍、羽衣甘藍的雙單倍體下胚軸作為受體，建立了發(fā)根農桿菌介導的轉化體系，后代沒有發(fā)現明顯的分離。

4.2 構建遺傳連鎖圖

DH（雙單倍體）群體在遺傳上具有絕對的純合性，是構建分子標記遺傳圖譜的重要材料。利用DH群體構建遺傳連鎖圖可以大大提高基因定位、作圖的準確性。由于所有的等位基因都是固定的，可以無限繁殖，并且保證長期性利用，因此DH群體是永久性群體。Pradhan等（2003）[58]利用源于印度芥菜雜交F1代的DH群體構建了高密度的連鎖圖。Kuginuki等（1997）[59]利用DH群體確定了與大白菜抗根腫病基因連鎖的三個RAPD標記，為構建遺傳連鎖圖奠定了基礎。張曉芬等（2005）[60]利用大白菜F1代游離小孢子培養(yǎng)建立的DH群體，篩選獲得了346個AFLP多態(tài)性標記，構建了大白菜遺傳連鎖圖譜。張立陽等（2005）[61]以大白菜高抗TuMV白心株系91-112和高感TuMV桔紅心株系T12-19為親本建立的小孢子培養(yǎng)DH群體作為圖譜構建群體，構建了包含406個標記、10個連鎖群的遺傳圖譜。王曉武等（2005）[62]利用芥藍和青花菜雜交F1經小孢子培養(yǎng)獲得的DH 群體，獲得了337個AFLP標記，構建了一個甘藍類作物較高密度的遺傳連鎖圖譜。Minamiyama（2006）[63]、Mimura（2009）[64]等利用辣椒DH群體，構建了基于SSR標記和AFLP標記的連鎖圖。

4.3 數量性狀的遺傳分析

DH群體是數量性狀分析的理想材料，可以重復進行檢驗，特別適合于品質、產量等數量性狀的分析。DH群體是永久純合的，不需要通過反復自交、回交，而且可以減少群體規(guī)模，大大減少了環(huán)境造成的遺傳分析誤差。

張樹根等（2008）[65]利用牛角椒DH群體對果實性狀進行了遺傳力分析，認為影響單果質量和果實橫徑的多基因間存在互補作用，控制果肉厚度的多基因間可能存在互補，而果實縱徑、果形指數各自的基因間無互作關系。張曉偉等（2009）[66]對來自抗病親本Y195293和感病親本Y177212的DH群體的TuMV抗性進行QTL分析，共檢測到3個QTLs，分別位于R03、R04和R06連鎖群上?？婓w云等（2008）[67]利用結球甘藍DH群體建立了主要農藝性狀的數量性狀主基因+多基因混合遺傳模型，分析了8個主要農藝性狀的遺傳效應，認為數量性狀主基因遺傳率中最高的是最大外葉柄長，外短縮莖長和中心柱長的主基因遺傳率較高，葉球高主基因遺傳率最低；多基因遺傳率中最高的是葉球高度，開展度受環(huán)境影響最大，而外葉柄長受環(huán)境影響最小。

4.4 突變體及抗病材料篩選

通過傳統的人工誘變育種方法選擇突變體時往往受到許多因素干擾，存在著性狀的顯隱性關系，很難做到正確選擇。而且為了增加選擇幾率，往往群體過大，很容易漏選或者誤選。單倍體只有一套染色體組，不存在基因位點的顯隱性，一旦發(fā)生突變就會在植株性狀上表現出來，隱性基因也可以直接表達，非常有利于對突變體進行篩選。Zhang和Takahata（1999）[68]利用小孢子培養(yǎng)系統，結合紫外線照射處理，篩選出了大白菜抗軟腐病突變體。Kuzuya等（2003）[69]篩選出了抗霜霉病的甜瓜單倍體植株。Valkonen等（1999）[70]從源于花藥培養(yǎng)的馬鈴薯品系中篩選出了GAs合成途徑部分受阻的矮化突變體。Jensen等（1999）[71]在青花菜DH群體中評價霜霉病抗性，篩選出抗霜霉病的青花菜植株。Vicente等（2002）[72]從甘藍中篩選出了抗黑腐病3號生理小種的DH系。獲得的這些突變體，若是雙單倍體，可以直接得到性狀穩(wěn)定的新種質；若是單倍體，需進一步通過加倍得到穩(wěn)定的純合二倍體后，才能直接應用于育種。

5 結語與展望

在過去的幾十年中，蔬菜單倍體誘導及應用技術取得了較大進展，開發(fā)出一些重復性好、誘導率高的培養(yǎng)程序，培育出許多有潛力的親本材料和新品種。但是仍有許多蔬菜種類尚未取得成功，而且已取得成功的蔬菜種類中也有一大部分無法應用于實際育種中。另外，某些蔬菜單倍體誘導率比較低，部分結果重復性不好，無法形成育種規(guī)模。今后有必要通過進一步研究優(yōu)化影響單倍體誘導頻率及加倍成雙單倍體的各種條件，深入探討參與單倍體植株形成的分子生物學和細胞生物學機制，相信將來會大大降低單倍體誘導的基因型依賴性，建立起優(yōu)化的雙單倍體加倍技術體系，從而與常規(guī)育種和現代分子育種技術緊密結合。

參 考 文 獻：

[1] 丁海鳳，于拴倉，王德欣，等.中國蔬菜種業(yè)創(chuàng)新趨勢分析 [J].中國蔬菜，2015（8）：1-7.

[2] Ferrie A M R， Caswell K L. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production [J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2010， 104（3）：301-309.

[3] Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus [J]. Zeitschrift Für Pflanzenphysiologie， 1982， 105（5）：427-434.

[4] Uchiyama H， Kameya T， Takahashi N. In vitro culture of unfertilized ovules in Solanum melongena and ovaries in Zea mays [J]. Japanese Journal of Breeding， 1971， 21（5）： 247-250.

[5] Bohanec B. Doubled haploids via gynogenesis [M]// Touraev A， Forster B P， Jain S M. Advances in haploid production in higher plants.Dordrecht： Springer Netherlands， 2009： 35-46.

[6] 楊紅麗，胡靖鋒，徐學忠，等. 影響甘藍小孢子胚狀體發(fā)生的因素研究 [J]. 山東農業(yè)科學，2015，47（2）：21-24.

[7] 方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.結球甘藍游離小孢子培養(yǎng)及植株再生[J]. 園藝學報，2006，33（1）：158-160.

[8] Nowaczyk P， Nowaczyk L， Olszewska D， et al. Androgenic response of genotypes selected from Capsicum annuum L.×C. chinense Jacq. hybrids [J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2009， 31（4）：877-879.

[9] Nowaczyk P， Olszewska D， Kisiaa A. Individual reaction of Capsicum F2 hybrid genotypes in anther cultures [J]. Euphytica， 2009， 168（2）：225-233.

[10]Zagorska N A， Shtereva A， Dimitrov D B， et al. Induced androgenesis in tomato （Lycopersicon esculentum Mill.） I. Influence of genotype on androgenetic ability[J]. Plant Cell Reports， 1998， 17（12）：968-973.

[11]莊飛云，裴紅霞，歐承剛，等.胡蘿卜小孢子胚狀體和愈傷組織的誘導[J]. 園藝學報，2010，37（10）：1613-1620.

[12]Bohanec B， Jake M. Variations in gynogenic response among long-day onion （Allium cepa L.） accessions [J]. Plant Cell Reports， 1999， 18（9）：737-742.

[13]Shalaby T A. Factors affecting haploid induction through in vitro gynogenesis in summer squash （Cucurbita pepo L.）[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 115（1）：1-6.

[14]Chen J F， Cui L， Malik A， et al. In vitro haploid and dihaploid production via unfertilized ovule culture[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2011， 104（3）：311-319.

[15]Supena E D J， Suharsono S， Jacobsen E， et al. Successful development of a shed-microspore culture protocol for doubled haploid production in Indonesian hot pepper （Capsicum annuum L.）[J]. Plant Cell Reports， 2006， 25（1）：1-10.

[16]Lantos C， Juhász A G， Somogyi G， et al. Improvement of isolated microspore culture of pepper （Capsicum annuum L.） via co-culture with ovary tissues of pepper or wheat [J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2009， 97（3）：285-293.

[17]Metwally E I， Moustafa S A， El-Sawy B I， et al. Haploid plantlets derived by anther culture of Cucurbita pepo[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 1998， 52（3）：171-176.

[18]Bal U， Abak K. Induction of symmetrical nucleus division and multicellular structures from the isolated microspores of Lycopersicon esculentum Mill [J]. Biotechnology & Biotechnological Equipment， 2005， 19（1）：35-42.

[19]Gémes-Juhász A， Balogh P， Ferenczy A， et al. Effect of optimal stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro gynogenesis induction in cucumber （Cucumis sativus L.）[J]. Plant Cell Reports， 2002， 21（2）：105-111.

[20]謝冰，王秀峰，樊治成. 西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及胚囊植株的產生[J].中國農業(yè)科學，2006，39（1）：132-138.

[21]Musial K， Bohanec B， Jakse M， et al. The development of onion （Allium cepa L.） embryo sacs in vitro and gynogenesis induction in relation to flower size[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2005， 41（4）：446-452.

[22]Segui-Simarro J M， Nuez F. Embryogenesis induction， callogenesis， and plant regeneration by in vitro culture of tomato isolated microspores and whole anthers[J]. Journal of Experimental Botany， 2007， 58（5）：1119-1132.

[23]Song H， Lou Q F， Luo X D， et al. Regeneration of doubled haploid plants by androgenesis of cucumber （Cucumis sativus L.）[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2007， 90（3）：245-254.

[24]Corral-Martínez P， Seguí-Simarro J. Efficient production of callus-derived doubled haploids through isolated microspore culture in eggplant （Solanum melongena L.）[J]. Euphytica， 2012， 187（1）：47-61.

[25]王燁，顧興芳，張圣平，等. 黃瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)及單倍體植株再生[J]. 園藝學報，2015，42（11）：2174-2182.

[26]栗根義，高睦槍，趙秀山.大白菜游離小孢子培養(yǎng)[J]. 園藝學報，1993，20（2）：167-170.

[27]劉穎穎，劉世琦，薛小艷，等. 大蒜未受精子房離體誘導單倍體的研究[J]. 園藝學報，2013，40（6）：1178-1184.

[28]陳曉峰，王承國，牟晉華，等. 大白菜游離小孢子培養(yǎng)和植株再生[J].山東農業(yè)科學，2014，46（3）：13-16.

[29]李菲，張淑江，章時蕃，等. 大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術高效體系的研究[J].中國蔬菜，2014（8）：12-16.

[30]Geoffriau E， Kahane R， Rancillac M. Variation of gynogenesis ability in onion （Allium cepa L.）[J]. Euphytica， 1997， 94（1）：37-44.

[31]Sulistyaningsih E， Yamashita K， Tashiro Y. Haploid induction from F1 hybrids between CMS shallot with Allium galanthum cytoplasm and common onion by unpollinated flower culture[J]. Euphytica， 2002， 125（1）：139-144.

[32]Kumar H A， Murthy H， Paek K. Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L[J]. Scientia horticulturae， 2003， 98（3）：213-222.

[33]Diao W P， Jia Y Y， Song H， et al. Efficient embryo induction in cucumber ovary culture and homozygous identification of the regenetants using SSR markers [J]. Scientia Horticulturae， 2009， 119（3）：246-251.

[34]Kiekowska A， Adamus A. In vitro culture of unfertilized ovules in carrot （Daucus carota L.）[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2010， 102（3）：309-319.

[35]Martinez L E， Aguero C B， Lopez M E， et al. Improvement of in vitro gynogenesis induction in onion （Allium cepa L.） using polyamines[J]. Plant Science， 2000， 156（2）：221-226.

[36]朱守亮，張恩慧，楊安平，等. 2個甘藍F1小孢子培養(yǎng)中高出胚率的誘導技術研究[J]. 西北農業(yè)學報，2009，18（6）：237-241.

[37]Germanà M. Anther culture for haploid and doubled haploid production[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2011， 104（3）：283-300.

[38]Germanà M. Gametic embryogenesis and haploid technology as valuable support to plant breeding[J]. Plant Cell Reports， 2011， 30（5）：839-857.

[39]da Silva Dias J C. Effect of incubation temperature regimes and culture medium on broccoli microspore culture embryogenesis[J]. Euphytica， 2001， 119（3）：389-394.

[40]Shtereva A L， Zagorska A N， Dimitrov D B， et al. Induced androgenesis in tomato （Lycopersicon esculentum Mill.）. II. Factors affecting induction of androgenesis[J]. Plant Cell Reports， 1998， 18（3）：312-317.

[41]Kiszczak W， Kowalska U， Kapus'cińska A， et al. Effect of low temperature on in vitro androgenesis of carrot （Daucus carota L.）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2015， 51（2）：135-142.

[42]Chen Z Z， Snyder S， Fan Z G， et al. Efficient production of doubled haploid plants through chromosome doubling of isolated microspores in Brassica napus[J]. Plant Breeding， 1994，113（3）：217-221.

[43]Zhang F L， Takahata Y. Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2001， 103（2/3）：254-258.

[44]Gu H H， Zhou W J， Hagberg P. High frequency spontaneous production of doubled haploid plants in microspore cultures of Brassica rapa ssp. chinensis[J]. Euphytica， 2003， 134（3）：239-245.

[45]Prem D， Gupta K， Sarkar G， et al. Activated charcoal induced high frequency microspore embryogenesis and efficient doubled haploid production in Brassica juncea[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2008， 93（3）：269-282.

[46]Li J R， Zhuang F Y， Ou C G， et al. Microspore embryogenesis and production of haploid and doubled haploid plants in carrot （Daucus carota L.）[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2013， 112（3）：275-287.

[47]Seguí-Simarro J M， Nuez F. Pathways to doubled haploidy： chromosome doubling during androgenesis[J]. Cytogenetic and Genome Research， 2008， 120（3/4）：358-369.

[48]張?zhí)煜瑁肿阽H，蔡坤秀，等. 蘆筍單倍體染色體加倍技術研究[J]. 中國農學通報，2011，27（13）：212-215.

[49]馮輝，姜鳳英，馮建云，等. 羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)技術研究及應用[J]. 園藝學報，2007，34（4）：1019-1022.

[50]張振超，耿鑫鑫，戴忠良，等. 甘藍類植物小孢子培養(yǎng)及植株再生研究[J]. 核農學報，2013，27（7）：929-937.

[51]Lim W， Earle E D. Enhanced recovery of doubled haploid lines from parthenogenetic plants of melon （Cucumis melo L.）[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2009， 98（3）：351-356.

[52]Lotfi M， Alan A R， Henning M J， et al. Production of haploid and doubled haploid plants of melon （Cucumis melo L.） for use in breeding for multiple virus resistance[J]. Plant Cell Reports， 2003， 21（11）：1121-1128.

[53]Rudolf K， Bohanec B， Hansen M. Microspore culture of white cabbage， Brassica oleracea var. capitata L.： genetic improvement of non-responsive cultivars and effect of genome doubling agents[J]. Plant Breeding， 1999， 118（3）：237-241.

[54]Grzebelus E， Adamus A. Effect of anti-mitotic agents on development and genome doubling of gynogenic onion （Allium cepa L.） embryos[J]. Plant Science， 2004， 167（3）：569-574.

[55]劉凡，姚磊，李巖，等. 利用大白菜小孢子胚狀體獲得抗除草劑轉基因植株[J].華北農學報，1998，13（4）：93-98.

[56]Tsukazaki H， Kuginuki Y， Aida R， et al. Agrobacterium-mediated transformation of a doubled haploid line of cabbage[J]. Plant Cell Reports， 2002， 21（3）：257-262.

[57]Cogan N， Harvey E， Robinson H， et al. The effects of anther culture and plant genetic background on Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of commercial cultivars and derived doubled-haploid Brassica oleracea[J]. Plant Cell Reports， 2001， 20（8）：755-762.

[58]Pradhan A， Gupta V， Mukhopadhyay A， et al. A high-density linkage map in Brassica juncea （Indian mustard） using AFLP and RFLP markers [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2003，106 （4）：607-14.

[59]Kuginuki Y， Ajisaka H， Yui M， et al. RAPD markers linked to a clubroot-resistance locus in Brassica rapa L.[J]. Euphytica， 1997， 98（3）：149-154.

[60]張曉芬，王曉武，婁平，等. 利用大白菜DH群體構建AFLP遺傳連鎖圖譜[J]. 園藝學報，2005，32（3）：443-437.

[61]張立陽，張鳳蘭，王美，等. 大白菜永久高密度分子遺傳圖譜的構建[J]. 園藝學報，2005，32（2）：249-255.

[62]王曉武，婁平，何杭軍，等. 利用芥藍×青花菜DH群體構建AFLP連鎖圖譜[J].園藝學報，2005，32（1）：30-34.

[63]Minamiyama Y， Tsuro M， Hirai M. An SSR-based linkage map of Capsicum annuum[J]. Molecular Breeding， 2006， 18（2）：157-169.

[64]Mimura Y， Kageyama T， Minamiyama Y， et al. QTL Analysis for resistance to Ralstonia solanacearum in Capsicum accession ‘LS2341[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science， 2009， 78（3）：307-313.

[65]張樹根，蔣鐘仁，邢永萍，等. 一個辣椒雜交種的加倍單倍體（DH） 群體果實性狀的遺傳分析[J]. 園藝學報，2008， 35（4）：515-520.

[66]張曉偉，原玉香，王曉武，等. 大白菜DH群體TuMV抗性的QTL定位與分析[J]. 園藝學報，2009，36（5）：731-736.

[67]繆體云，劉玉梅，方智遠，等. 一個結球甘藍DH群體主要農藝性狀的遺傳效應分析[J]. 園藝學報，2008，35（1）： 59-64.

[68]Zhang F L， Takahata Y. Microspore mutagenesis and in vitro selection for resistance to soft rot disease in Chinese cabbage （Brassica campestris L. ssp. pekinensis）[J]. Breeding Science， 1999， 49（3）：161-166.

[69]Kuzuya M， Hosoya K， Yashiro K， et al. Powdery mildew （Sphaerotheca fuliginea） resistance in melon is selectable at the haploid level[J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（384）：1069-1074.

[70]Valkonen J P T， Moritz T， Watanabe K N， et al. Dwarf （di）haploid pito mutants obtained from a tetraploid potato cultivar （Solanum tuberosum subsp. tuberosum） via anther culture are defective in gibberellin biosynthesis[J]. Plant Science， 1999， 149（1）：51-57.

[71]Jensen B D， Vrbak S， Munk L， et al. Characterization and inheritance of partial resistance to downy mildew， Peronospora parasitica， in breeding material of broccoli， Brassica oleracea convar. botrytis var. italica[J]. Plant Breeding， 1999， 118（6）：549-554.

[72]Vicente J G， Taylor J D， Sharpe A G， et al. Inheritance of race-specific resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica genomes[J]. Phytopathology， 2002， 92（10）：1134-1141.