應用酵母雙雜交系統篩選LKB1相互作用蛋白

徐 卿，李洪濤，林 峰，姚 陽

LKB1(liver kinase B1)即STK11(serine/threonine protein kinase 11)，首次是在黑斑息肉綜合征研究中被報道的[1]，其在胰腺、肝臟等機體器官組織中廣泛表達。LKB1基因可編碼一個由436位氨基酸組成的蛋白質，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，N端第38～43位氨基酸殘基是其核定位信號序列、第50～319位氨基酸為其激酶催化域。LKB1通過核定位信號序列主要定位于細胞核內，在胞質中表達相對較少，然而LKB1的功能主要與其胞質內的部分有關[2-3]。研究[4-5]顯示，LKB1通過磷酸化其底物腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)，從而激活AMPK，負向調節mTOR的活性，在控制和調節細胞能量代謝、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和細胞極性中發揮著重要作用。為更清楚了解LKB1在體內的作用機制，揭示LKB1可能存在的新功能，該研究利用酵母雙雜交系統，以LKB1為誘餌，篩選人類全基因組開放閱讀框酵母雙雜交文庫，尋找能與之相互作用的蛋白。

1 材料與方法

1.1試劑與材料GAL4酵母雙雜交系統與human ORFeome Y2H library文庫、轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；Yeast Nitrogen Base、Bacto-yeast extract、Bacto-Peptone 購自美國BD公司；PEG50、葡萄糖、醋酸鋰、谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione-S-transferase,GST)及GST融合蛋白、各種氨基酸購自上海拜科生物科技公司；3-氨基-1，2，4-三唑、玻璃珠購自美國Sigma公司；Glutathione Sepharose 4B beads購自上海軼漚生物科技有限公司；質粒小量提取試劑盒購自美國Promega公司；酵母質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Tag酶、DNA限制性內切酶購自美國NEB公司；T4DNA連接酶購自北京全式金生物技術有限公司；XgaI、DMEM高糖培養基與胎牛血清購自美國Gibco公司；增強化學發光顯色試劑盒購自美國Pierce公司；Mav203細菌感受態為實驗室保存。

1.2方法

1.2.1構建Bait質粒 LKB1全長克隆到pDONR221載體，通過Gateway cloning reaction (美國Invitrogen公司)轉移到含有GAL4 DNA binding domain的pDEST32載體，構建Bait載體pDEST32- LKB1，用LiAc轉化法將pDEST32-LKB1轉化入Mav203酵母菌株，轉化成功的菌株通過SD-leu的培養基選擇性篩選陽性克隆，將轉化了pDEST32- LKB1的酵母菌株制成感受態細胞。

1.2.2自激活檢測 用LiAc轉化法將含有GAL4 activating domain的prey質粒空載 (pDEST22)轉化含有Bait基因的感受態細胞，轉化后同時涂布二缺板SD-2(SD-Leu-Trp)和4缺板SD-4(SD-Leu-Trp-His-Ura)的營養缺陷板，如果能在SD-4上生長說明有自激活效應，該Bait蛋白能與GAL4 activating domain相互作用。沒有自激活效應再進行下一步篩選。

1.2.3文庫篩選 用LiAc轉化法將prey質粒(human ORFeome Y2H library)轉化該菌株，轉化后同時涂布SD-2和SD-4的營養缺陷板，SD-Leu-Trp的培養板可以用于轉化效率的評估，陽性克隆可以在SD-4的培養板上生長并且使X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside,美國Sigma公司)顯藍色，抽取酵母陽性克隆質粒轉化大腸桿菌，抽質粒測序，確定陽性克隆基因。

1.2.4克隆驗證 將Bait和Prey載體共同轉化酵母菌株Mav203并分別涂布SD-2和SD-4酵母培養板，X-Gal顯色反應驗證相互作用。將回轉陽性的質粒送上海鉑尚生物技術有限公司測序。測序結果在美國國立生物技術信息中心網站上進行序列比對分析。

1.2.5HERC3真核表達載體構建 以含HERC3全長cDNA為模板通過下游帶有HA標簽的引物，運用PCR方法擴增HERC3全長序列( 正向引物:5′-CGGAATTCATGTTATGTTGGGGATATTG-3′；反向引物: 5′-ATGAAGGGTTTAGTTTGGCCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTAACTCGAGCGG-3′)。PCR產物經過EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，與pcDNA3.1(+)載體用T4 DNA連接酶在16 ℃的條件下連接過夜。然后將連接的產物轉化搖菌，用小抽試劑盒抽提質粒，PCR鑒定正確后送至上海鉑尚生物技術有限公司測序。

1.2.6細胞培養及轉染 HEK293FT細胞在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養基中培養。待細胞生長狀況良好時，胰酶消化并接種培養皿中，當細胞密度生長至70%～80%時，換成無雙抗的Opti-DMEM培養基培養，并用Opti-DMEM培養基將Lipofectamine2000以及質粒以1 ∶1的比例混勻，室溫孵育20 min，再均勻加入相應培養皿中，轉染4～6 h后換為含10%胎牛血清、0.1%青霉素和鏈霉素的DMEM 高糖培養基繼續培養。

1.2.7免疫共沉淀 ① 收集細胞，加500 μl細胞裂解液RIPA buffer (添加PMSF) 裂解細胞。② 裂解細胞于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液。其中需另外留取50 μl上清液，加入5×SDS樣品緩沖液，煮沸10 min，-20 ℃保存留作Input的樣品。③ 免疫共沉淀：加入1 μg抗體，4 ℃充分混勻4 h或者過夜。再加入20 μl用細胞裂解液平衡過的protein G beads，4 ℃充分混勻4 h。1 000 r/min離心3 min，棄上清液。加1 ml細胞裂解液，4 ℃輪轉10 min, 1 000 r/min離心3 min，棄上清液，重復洗滌3次。④ Western blot檢測：吸盡上清液，加60 μl 1×SDS樣品緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液電泳，Western blot檢測沉淀及共沉淀蛋白質。

1.2.8GST-Pull down 按照實驗組別分別加入GST-LKB1融合蛋白(對照組用GST蛋白)和過表達HERC3的細胞裂解液，然后分別加入等量Glutathione Sepharose 4B beads，并補充GST-Pull down buffer 到總體積500 μl。4 ℃充分混勻4 h后，GST-Pull down buffer漂洗3次，煮樣，Western blot檢測沉淀蛋白。

1.3統計學處理數據采用 SPSS 16.0軟件進行分析，兩組間實驗數據的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1E3連接酶HERC3能夠與LKB1蛋白相互作用利用已有的cDNA文庫，采用酵母雙雜交方法篩選到HERC3能與LKB1相互作用。HERC3屬于E3連接酶，含有染色體濃縮調節因子1相似結構域和同源E6-AP羧基末端結構域。HERC3與LKB1的相互作用能夠使酵母在4缺板SD-4(SD-Leu-Trp-His-Ura)上生長，并能夠激活β-galactosidase活性。見圖1。

圖1 酵母雙雜交系統檢測LKB1與HERC3有相互作用

A:HERC3+LKB1共轉并在SD-2上生長; B: Blank+LKB1共轉并在SD-2上生長；C: HERC3+LKB1共轉并在SD-4上生長; D: Blank+LKB1共轉并在SD-4上生長；藍色為陽性克隆

2.2pcDNA3.1-HERC3-HA真核表達載體的構建及鑒定構建成功的重組質粒pcDNA3.1-HERC3-HA經過PCR檢測鑒定，經過DNA Marker比對后，顯示與目的片段條帶位置一致，證明連接是成功的。然后送測序，序列與基因庫序列一致，質粒構建成功。見圖2。

2.3HERC3與LKB1在細胞內的相互作用采用免疫共沉淀的實驗方法，將帶有Flag標簽的LKB1和帶有HA標簽的HERC3質粒共轉染HEK293FT細胞，同時分別設置pcDNA3.1-Flag +pcDNA3.1-HERC3-HA和IP：IgG作為陰性對照。結果表明，HERC3和LKB1結合，而不與Flag標簽結合，說明HERC3和LKB1蛋白在細胞內存在特異性的相互作用。見圖3。

圖2 重組質粒pcDNA3.1-HERC3-HA PCR鑒定電泳圖

A:DNA Marker; B：以cDNA文庫為模板PCR方法擴增HERC3；C：重組質粒PCR鑒定HERC3條帶

圖3 HERC3與LKB1在HEK293FT細胞內的相互作用

1:LKB1-Flag; 2: HERC3-HA+pCDNA3-Flag共轉; 3: HERC3-HA+LKB1-Flag共轉

2.4GST-Pulldown驗證HERC3與LKB1的相互作用以GST-LKB1融合蛋白為誘餌蛋白,過表達HERC3的細胞總蛋白為捕獲蛋白,分別設置HERC3-HA+GST蛋白組、HERC3-HA+GST-LKB1融合蛋白組，進行Pull-down實驗,最后收集到的樣品進行Western blot檢測沉淀蛋白。結果表明，GST-LKB1能夠特異性結合HERC3，而GST蛋白不能夠沉淀HERC3。見圖4。

3 討論

目前研究[6]表明，LKB1參與體內多種生物學過程：① LKB1能夠抑制腫瘤細胞的增殖，阻滯細胞周期在G1期；② LKB1能夠抑制mTOR通路的活性，減少細胞內蛋白合成；③ LKB1在細胞的極性調控中發揮著關鍵性作用。Wilkinson et al[7-8]發現，LKB1通過和STRAD蛋白形成復合物而活化后，能夠在沒有細胞間連接和其他極性誘導因素的條件下，使單個的小腸上皮細胞自發性形成頂-基極性。

圖4 GST-Pull down驗證HERC3與LKB1的相互作用

A: HERC3-HA+GST蛋白；B: HERC3-HA+GST-LKB1融合蛋白

近年來有大量研究[9-10]表明，LKB1不僅僅是PJS的致病基因，也是多種腫瘤發生的重要基因，如肺癌、乳腺癌、胃癌等，LKB1在腫瘤的發生、分化、轉移中發揮至關重要的作用，在前列腺癌中LKB1通過AMPK通路發揮其抑癌作用；在乳腺癌中，LKB1-AMPK通過作用于mTOR發揮其抑癌作用。

HERC3作為同源E6-AP羧基末端結構域家族的泛素連接酶E3，可以直接催化靶蛋白的泛素化。已有研究[11]顯示，在胃癌、結腸癌中HERC3存在突變。HERC3與hPLIC-1和hPLIC-2相互作用并定位于晚期內涵體和溶酶體[12]。HERC3通過其E3連接酶功能泛素化并促進NF-KB RelA降解，進而負調NF-κB信號通路[13]。

泛素化修飾屬于蛋白質翻譯后修飾的一種，通過泛素-蛋白酶系統介導參與的調節蛋白質降解的過程，普遍存在于真核細胞中。泛素化修飾對于蛋白質的穩定性、亞細胞定位及信號轉導過程等具有重要的調節功能。其中泛素連接酶E3決定了底物識別的特異性并最終催化底物蛋白的泛素化過程。HERC3屬于膜轉運所涉及的E3泛素連接酶家族，主要分布在胞質。該家族一般包含一個同源E6-AP羧基末端結構域和一個或多個染色體濃縮調節因子1相似結構域(RCC1-like結構域)， LKB1在胞質也有分布，而且LKB1的主要功能也與其胞質部分相關[14]。

對于LKB1在疾病中的確切分子機制目前仍未明確，本研究采用酵母雙雜交方法成功篩選出HERC3與LKB1在體內存在相關作用，同時利用免疫共沉淀實驗以及GST-Pull down實驗分別在體內外對二者的相互作用進行進一步驗證。結果顯示LKB1在體內外均可以有效地結合HERC3，說明了其相互作用的可靠性。提示HERC3有可能通過與LKB1特異性的結合進而影響LKB1所參與體內多種生物學過程。對于HERC3可能涉及或參與調控LKB1作用的方式還有待于進一步的研究與探索，可能對腫瘤的診斷治療、為藥物開發提供靶點及理論指導具有一定的意義。

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