基于甲酰四氫葉酸合成酶基因解析厭氧消化系統(tǒng)中互營乙酸氧化菌群

易 悅， 董 劼， 王慧中， 鄭 丹， 茍 敏， 湯岳琴

(1.四川大學 建筑與環(huán)境學院， 環(huán)境科學與工程系， 四川 成都 610065； 2.四川省環(huán)境保護有機廢棄物資源化利用重點實驗室， 四川 成都 610065)

互營乙酸氧化菌與氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌互營共生產(chǎn)生的能量需要維持這兩種微生物的生命代謝活動，其能量劣勢導致互營乙酸氧化菌生長緩慢，分離周期長[11]，在現(xiàn)有培養(yǎng)技術條件下，對互營乙酸氧化菌進行分離培養(yǎng)非常具有挑戰(zhàn)性。到目前為止，已分離培養(yǎng)的互營乙酸氧化菌僅有6株，分別為1988年由Lee和Zinder[12]在高溫厭氧環(huán)境中得到的菌株AOR;1996年由Schnürer[13]分離培養(yǎng)的嗜中溫互營乙酸氧化菌ClostridiumultunenseBS;2000年Hattori[14]從高溫甲烷發(fā)酵反應器中分離培養(yǎng)的ThermacetogeniumphaeumPB[14];2002年Balk[15]從硫酸鹽還原厭氧反應器中分離培養(yǎng)的嗜高溫乙酸氧化菌ThermotogalettingaeTMO;2010年Westerholm[16]在中溫厭氧反應器中得到的SyntrophaceticusschinkiiSp3以及2011 年Westerholm[17]在中溫富氨厭氧反應器中分離得到TepidanaerobacteracetatoxydansRe1[17]。除菌株AOR丟失外，其它5株菌都是嚴格厭氧菌，它們都能與產(chǎn)甲烷古菌共培養(yǎng)，進行互營乙酸氧化產(chǎn)甲烷。這6株菌中只有ClostridiumultunenseBS是中溫菌， 最適生長溫度為37℃；其余五株菌均為嗜熱菌，最適生長溫度都在 55℃～65℃。

由于互營乙酸氧化菌的難培養(yǎng)性，基于分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法難以全面認識厭氧消化系統(tǒng)中的互營乙酸氧化菌。以互營乙酸氧化途徑關鍵功能基因為對象，利用分子生態(tài)學方法進行互營乙酸氧化菌群研究將是一條深入了解厭氧消化系統(tǒng)中互營乙酸氧化菌群分布和多樣性的有效途徑。

筆者采集了分別來自供給原料不同、運行溫度不同的濕式和干式的厭氧反應器的消化污泥，根據(jù)樣品的來源特征構建3個fhs克隆文庫(以乙酸為唯一碳源的中溫厭氧消化體系克隆文庫—C，中溫厭氧消化體系克隆文庫—M，高溫厭氧消化體系克隆文庫—H)，用以研究不同厭氧反應器中互營乙酸氧化菌群的多樣性和分布規(guī)律，這對解析厭氧消化產(chǎn)甲烷過程的微生物學過程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及總DNA提取

研究采集了分別來自供給原料不同、運行溫度不同的濕式和干式的厭氧反應器的消化污泥(見表1)，采用CTAB法提取各樣品總DNA[8]。

表1 厭氧反應器供給原料及運行參數(shù)

1.2 乙酸氧化菌功能基因fhs的PCR擴增

以提取的DNA為模板，利用引物FTHFSf (5′-T TYACWGGHGAYTTCCATGC-3′)和FTHFSr(5′-GTA TTGDGTYTTRGCCATACA-3′)[27]進行fhs基因的PCR擴增。擴增體系為 10×PCR buffer(Mg2+Plus)5 μl，dNTP mixture(各2.5 mM) 4 μl，正向引物FTHFSf(10 mmol·L-1)1 μl，反向引物 FTHFSr(10 mmol·L-1)1 μl，滅菌水36.5 μl，DNA聚合酶0.5μl，DNA模板2 μl。擴增條件為 94 ℃，5 min；94 ℃，40 s；49℃，40 s；72 ℃，1 min；40 個循環(huán)；72 ℃，10 min。瓊脂糖電泳確認PCR產(chǎn)物。

1.3 克隆文庫構建

根據(jù)樣品的來源特征構建3個FTHFS基因克隆文庫：利用C1反應器PCR產(chǎn)物構建中溫厭氧消化體系克隆文庫(C)；利用M1～M3的PCR產(chǎn)物混合物構建中溫厭氧消化體系克隆文庫(M)；利用H1～H10的PCR產(chǎn)物混合物構建高溫厭氧消化體系克隆文庫(H)。

將PCR擴增得到的目標片段用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工)進行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T 載體進行連接，使用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，37℃培養(yǎng)約16個小時，使用T載體通用引物M13-47(5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′)，Rv-m(5′-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3′)對克隆子進行PCR驗證。

1.4 酶切分型和測序分析

使用MspI及AfaI對陽性克隆子的PCR產(chǎn)物進行酶切，根據(jù)酶切片段分布將克隆子進行分類，每類選取1～3個代表克隆子進行測序，堿基序列相似性大于等于97%的克隆子為同一操作分類單元(OTU)。將堿基序列翻譯為氨基酸序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行相似序列比對，采用MEGA 4軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。所獲得的OTU序列提交GenBank，編號為KX874498至KX874527。

2 結果與討論

從C，M，H文庫中分別挑取了37，54，34個陽性克隆子，根據(jù)酶切分型結果分別選擇了17，20，21個代表克隆進行測序，將堿基序列翻譯為氨基酸序列，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。表2為3個克隆文庫中OTU的系統(tǒng)分類情況。

C，M，H文庫分別有5，11和14個OTU。3個文庫克隆分布差異大，沒有共有OTU，M和H間只有1個OTU (M50和H61)共有。C文庫的克隆分布在Chloroflexi，Thermotogae及Firmicutes這3個門，主要集中在Firmicutes的Thermoanaerobacterales中，占總克隆子數(shù)量的85.71%。M文庫的克隆分布在Bacteroidetes，Synergistetes及Firmicutes這3個門，主要集中在Firmicutes的Thermoanaerobacterales和Clostridiales中，分別占總克隆子數(shù)量的28.57%和48.57%。H文庫中約97%的克隆都分類于Firmicutes，主要集中在Clostridiales中，占總克隆子數(shù)量的60.60%，H文庫中其它3.03%的克隆無法分類。

圖1 基于fhs基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

C文庫的OTU數(shù)量明顯少于M和H文庫，可能是因為使用單一碳源乙酸長期培養(yǎng)，體系物種多樣性降低。H文庫的OTU數(shù)量略高于M文庫，可能是因為高溫環(huán)境中，互營乙酸氧化可能是乙酸分解的主要途徑[31-33]。3個文庫中的OTU大部分都集中在Firmicutes中，表明潛在的互營乙酸氧化菌的大部分可能分屬于該門，Clostridiales和Thermoanaerobacterales是3個文庫共有的，只在H文庫中檢測到有克隆分類與Bacilli和Halanaerobiales。在門水平上，兩個中溫文庫C和M具有更高的多樣性。這些結果表明溫度對于乙酸互營降解菌的分布可能有一定的影響。Sun[34]等人通過研究不同溫度條下CSTR厭氧反應器中互營乙酸氧化也得到了相似結論。

表2 3個克隆文庫中OTU的系統(tǒng)分類 (%)

在C文庫中，OTU C65相對豐度(85.71%)最高，與Tepidanaerobactersyntrophicus具有100%的相似度。Tepidanaerobactersyntrophicus是能分解伯醇和乳酸的嚴格厭氧互營細菌，分離自高溫消化污泥，最適生長溫度為45℃～50℃，能在25℃～60℃環(huán)境中生存，與氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷古菌互營生長[35]。OTU C12(2.86%)與已知的能利用多種氨基酸作為碳源，生成乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等物質(zhì)的Clostridiumsticklandii具有99%相似度[36]。OTU C14(5.71%)，OTU C13(2.86%)和OTU C51(2.86%)均沒有與之相似度較高的微生物或未培養(yǎng)克隆。

M文庫中相對豐度最高的OTU M4(28.57%)與Tepidanaerobactersyntrophicus具有95%的相似度。相對豐度第2的OTU M59(25.71%)和相對豐度第3的OTU M68(8.57%)以及OTU M88(2.86%)與已知的中溫互營乙酸氧化菌Clostridiumultunense[13]聚類，其相似度在80%～99%的范圍內(nèi)，可以認為這3個OTU代表的細菌可能是互營乙酸氧化菌。OTU M52(2.86%)與從鈾污染的含水土層中分離出來的能夠氧化乳酸的Desulfitobacteriummetallireducens[37]具有92%相似度；OTU M50與以乙酸為碳源的中溫厭氧消化反應器中發(fā)現(xiàn)的未培養(yǎng)細菌N10[38]的fhs基因的其中一個拷貝具有99%相似度。OTU M101 (3.03%)與油藏環(huán)境中的Synergistalesbacterium[39]在系統(tǒng)發(fā)育上比較接近。其余的4個OTU均沒有與之相似度較高的微生物或未培養(yǎng)克隆。

在H文庫中，相對豐度最高的OTU H20(39.39%)，OTU H9(3.03%)及OTU H29(3.03%)在系統(tǒng)發(fā)育樹上單獨聚類(包括M23)，總量占H文庫的45.45%，這些OTU無相似微生物或克隆，可能是高溫條件下主要的乙酸氧化菌。OTU H53(9.09%)與已知的互營乙酸氧化菌Clostridiumultunense具有90%的相似性。OTU H61(6.06%)和OTU H64(3.03%)分別與未培養(yǎng)細菌N10[38]的fhs基因的兩個不同拷貝具有99%和93%的相似性。OTU H108(6.06%)與一個未知細菌克隆具有99%的相似性。其余的7個OTU均沒有與之相似度較高的微生物或未培養(yǎng)克隆。

由以上分析可以看出，所獲得OTU中，只有OTU M88和已知的互營乙酸氧化菌具有很高的相似性(99%)。盡管已知的互營乙酸氧化菌大部分為高溫菌，但在H文庫中沒有發(fā)現(xiàn)和已知高溫互營乙酸氧化菌相似的OTU。可以認為，厭氧消化系統(tǒng)中存在大量未知的互營乙酸氧化菌。由于C文庫是以乙酸為唯一碳源的厭氧系統(tǒng)的文庫，在以乙酸為唯一碳源的厭氧系統(tǒng)中，乙酸分解占主要地位，同型乙酸合成則可以不考慮，因此C文庫中獲得的OTU都是可能的互營乙酸氧化菌。

少數(shù)幾個OTU和已知微生物間具有相對較高的相似性，如和Tepidanaerobactersyntrophicus及Clostridiumsticklandii具有較高相似性的OTU C65，OTU M4，OTU C12，它們均來源于C文庫。Tepidanaerobactersyntrophicus屬于Thermoanaerobacteriales目。Nazina[40]等發(fā)現(xiàn)在中國大港油田中Thermoanaerobacteriales是參與互營乙酸氧化產(chǎn)甲烷的主要細菌類群； Robin[30]等發(fā)現(xiàn)的和Thermacetogenium kivui具有較高相似性的潛在乙酸氧化菌也屬于Thermoanaerobacteriales目；已知的乙酸氧化菌中，Tepidanaerobacteracetatoxydans及Thermacetogeniumphaeum也屬于Thermoanaerobacteriales目?？梢酝茰y， Thermoanaerobacteriales可能在許多環(huán)境條件下都是參與互營乙酸氧化產(chǎn)甲烷的主要細菌類群。筆者研究中檢測到的其它分屬于該目的OTU M4，M12，M19，H2，H10則都是可能的互營乙酸氧化菌。

3 結論

筆者研究采集了分別來自供給原料不同、運行溫度不同的濕式和干式的厭氧反應器的消化污泥，根據(jù)樣品的來源特征構建3個fhs克隆文庫，研究了乙酸氧化菌群的多樣性和分布情況。結果表明，在厭氧消化系統(tǒng)中存在大量未知的互營乙酸氧化菌，且多樣性高，運行溫度對互營乙酸氧化菌群具有一定影響。今后需要結合宏組學等手段對這些可能的互營乙酸氧化菌群進行深入研究，揭示它們的遺傳和代謝特征，以及它們在厭氧消化環(huán)境中分布規(guī)律和對環(huán)境因子的相應特征，為厭氧消化系統(tǒng)的調(diào)控和穩(wěn)定運行提供基礎。

[1] Speece R E.Anaerobic biotechnology for industrial wastewater treatment[J].Environmental Science Technology, 1983, 17(9): 520-521.

[2] Schink B.Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation[J].Microbiology Molecular Biology Reviews, 1997, 61(2): 262-280.

[3] Oren A.The Family Methanosarcinaceae[M].Berlin ：Springer Berlin Heidelberg, 2014: 259-281.

[4] Hattori S.Syntrophic acetate-oxidizing microbes in methanogenic environments[J].Microbes Environments, 2008, 23(2): 118-127.

[5] Shigematsu T, Tang Y, Kobayashi T, et al.Effect of dilution rate on metabolic pathway shift between aceticlastic and nonaceticlastic methanogenesis in chemostat cultivation[J].Applied Environmental Microbiology, 2004, 70(7): 4048-4052.

[6] Karakashev D, Batstone D J, Trably E, et al.Acetate oxidation is the dominant methanogenic pathway from acetate in the absence of methanosaetaceae[J].Applied Environmental Microbiology, 2006, 72(7): 5138-5141.

[7] Hao L P, Fan L, He P J, et al.Predominant contribution of syntrophic acetate oxidation to thermophilic methane formation at high acetate concentrations[J].Environmental Science Technology, 2011, 45(2): 508-513.

[8] Shigematsu T, Tang Y, Kawaguchi H, et al.Effect of dilution rate on structure of a mesophilic acetate-degrading methanogenic community during continuous cultivation[J].Journal of Bioscience Bioengineering, 2003, 96(6): 547-558.

[9] Baere L A, Devocht M, Assche P V, et al.Influence of high NaCl and NH4Cl salt levels on methanogenic associations[J].Water Research, 1984, 18(5): 543-548.

[10] Thauer R K, Jungermann K, Decker K.Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria[J].Bacteriological Reviews, 1977, 41(1): 100-180.

[11] Jackson B E, Mcinerney M J.Anaerobic microbial metabolism can proceed close to thermodynamic limits[J].Nature, 2002, 415(6870): 454-456.

[12] Lee M J, Zinder S H.Isolation and characterization of a thermophilic bacterium which oxidizes acetate in syntrophic association with a methanogen and which grows acetogenically on H2-CO2[J].Applied Environmental Microbiology, 1988, 54(1): 124-129.

[13] Schnürer A, Schink B, Svensson B H.Clostridiumultunensesp.nov, a mesophilic bacterium oxidizing acetate in syntrophic association with a hydrogenotrophic methanogenic bacterium[J].International Journal of Systematic Bacteriology, 1996, 46(4): 1145-1152.

[14] Hattori S, Kamagata Y, Hanada S, et al.Thermacetogeniumphaeumgen.nov, sp.nov, a strictly anaerobic, thermophilic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium[J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, 2000, 50(4): 1601-1609.

[15] Balk M, Weijma J, Stams A J.Thermotogalettingaesp.nov, a novel thermophilic, methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor[J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, 2002, 52(4): 1361-1368.

[16] M W, S R, A S.Syntrophaceticusschinkiigen.nov, sp.nov, an anaerobic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium isolated from a mesophilic anaerobic filter[J].FEMS Microbiology Letters, 2010, 309(1): 100-104.

[17] Westerholm M, Roos S, Schnürer A.Tepidanaerobacteracetatoxydanssp.nov, an anaerobic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium isolated from two ammonium-enriched mesophilic methanogenic processes[J].Systematic Applied Microbiology, 2011, 34(4): 260-266.

[18] Lee M J, Zinder S H.Carbon monoxide pathway enzyme activities in a thermophilic anaerobic bacterium grown acetogenically and in a syntrophic acetate-oxidizing coculture[J].Archives of Microbiology, 1988, 150(6): 513-518.

[19] Schnürer A, Bo H S, Schink B.Enzyme activities in and energetics of acetate metabolism by the mesophilic syntrophically acetate-oxidizing anaerobeClostridiumultunense[J].FEMS Microbiology Letters, 1997, 154(2): 331-336.

[20] Sieber J R, Mcinerney M J, Plugge C M, et al.Methanogenesis: Syntrophic Metabolism[M].Springer Berlin Heidelberg, 2010: 337-355.

[21] Hattori S, Galushko A S, Kamagata Y, et al.Operation of the CO dehydrogenase/acetyl coenzyme A pathway in both acetate oxidation and acetate formation by the syntrophically acetate-oxidizing bacteriumThermacetogeniumphaeum[J].Journal of Bacteriology, 2005, 187(187): 3471-3476.

[22] Müller B, Manzoor S, Niazi A, et al.Genome-guided analysis of physiological capacities ofTepidanaerobacteracetatoxydansprovides insights into environmental adaptations and syntrophic acetate oxidation[J].PLoS One, 2014, 10(3): 599-603.

[23] Nobu M K, Narihiro T, Rinke C, et al.Microbial dark matter ecogenomics reveals complex synergistic networks in a methanogenic bioreactor[J].ISME Journal, 2015, 9(8): 1-13.

[24] Curthoys N P, Rabinowitz J C.Formyltetrahydrofolate synthetase[J].Journal of Biological Chemistry, 1972, 247(7): 1965-1971.

[25] Müller B, Sun L, Schnürer A.First insights into the syntrophic acetate-oxidizing bacteria-a genetic study[J].MicrobiologyOpen, 2013, 2(1): 35-53.

[26] Leaphart A B, Lovell C R.Recovery and analysis of formyltetrahydrofolate synthetase gene sequences from natural populations of acetogenic bacteria[M].Cambridge：Cambridge University Press, 2007: 1392-1395.

[27] Hori T, Sasaki D, Haruta S, et al.Detection of active, potentially acetate-oxidizing syntrophs in an anaerobic digester by flux measurement and formyltetrahydrofolate synthetase (FTHFS) expression profiling[J].Microbiology, 2011, 157(7): 1980-1989.

[28] Akutsu Y, Li Y Y, Harada H, et al.Effects of temperature and substrate concentration on biological hydrogen production from starch[J].International Journal of Hydrogen Energy, 2009, 34(6): 2558-2566.

[29] Ryan P, Forbes C, Mchugh S, et al.Enrichment of acetogenic bacteria in high rate anaerobic reactors under mesophilic and thermophilic conditions[J].Water Research, 2010, 44(14): 4261-4269.

[30] Robin H.The effects of trace elements on the microbial communities of thermophilic biogas production[D].Campus Ultuna ：Sveriges lantbruksuniversitet, 2016.

[31] Goberna M, Insam H, Frankewhittle I H.Effect of biowaste sludge maturation on the diversity of thermophilic bacteria and archaea in an anaerobic reactor[J].Applied Environmental Microbiology, 2009, 75(8): 2566-2572.

[32] Krakat N, Westphal A, Schmidt S, et al.Anaerobic digestion of renewable biomass: thermophilic temperature governs methanogen population dynamics[J].Applied Environmental Microbiology, 2010, 76(6): 1842-1850.

[33] Sasaki D, Hori T, Haruta S, et al.Methanogenic pathway and community structure in a thermophilic anaerobic digestion process of organic solid waste[J].Journal of Bioscience Bioengineering, 2011, 111(1): 41-46.

[34] Sun L, Müller B, Westerholm M, et al.Syntrophic acetate oxidation in industrial CSTR biogas digesters[J].Journal of Biotechnology, 2014, 171(1): 39-44.

[35] Sekiguchi Y, Imachi H, Susilorukmi A, et al.Tepidanaerobactersyntrophicusgen.nov., sp.nov., an anaerobic, moderately thermophilic, syntrophic alcohol- and lactate-degrading bacterium isolated from thermophilic digested sludges[J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, 2006, 56(7): 1621-1629.

[36] Fonknechten N, Chaussonnerie S, Tricot S, et al.Clostridiumsticklandii, a specialist in amino acid degradation:revisiting its metabolism through its genome sequence[J].BMC Genomics, 2010, 11(1): 1-12.

[37] Finneran K T, Forbush H M, Vanpraagh C V G, et al.Desulfitobacteriummetallireducenssp.nov., an anaerobic bacterium that couples growth to the reduction of metals and humic acids as well as chlorinated compounds[J].International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, 2002, 52(6): 1929-1935.

[38] Westerholm M, Müller B, Arthurson V, et al.Changes in the acetogenic population in a mesophilic anaerobic digester in response to increasing ammonia concentration[J].Microbes and Environments, 2011, 26(4): 347-353.

[39] Hu P, Tom L, Singh A, et al.Genome-resolved metagenomic analysis reveals roles for candidate phyla and other microbial community members in biogeochemical transformations in oil reservoirs[J].mBio, 2016, 7(1): e01669-15.

[40] Nazina T N, Shestakova N M, Grigor′ian A A, et al.Phylogenetic diversity and activity of anaerobic microorganisms of high-temperature horizons of the Dagang oil field (China)[J].Microbiology, 2006, 75(1): 55-65.