破壁預處理對小球藻藻渣產沼氣性能的影響

周銀存， 趙新仕， 楊 迪， 畢生雷， 魯 龍， 胡守珍，， 張乃群

(1.南陽師范學院 生命科學與技術學院， 河南 南陽 473061； 2.河南天冠企業集團有限公司 車用生物燃料技術國家重點實驗室， 河南 南陽 473000)

小球藻是一種普生性單細胞綠藻[1]，適應性比較強、廣泛分布于淡水、海水等各種環境，甚至冰層、火山口等極端環境也有分布。小球藻因其生長迅速、生長周期短、占地面積小、可以使用工業化設備進行規模化培養等特點而備受關注[2]，小球藻用途廣泛，富含的藻多糖、藻蛋白、天然色素、小球藻生長因子等高附加值產物被使用在食品、美容等領域，高油脂含量也決定了其是制備生物柴油的優質原料[3]。

雖然小球藻可利用價值高，但小球藻產品多為胞內產物。小球藻細胞壁相對較厚且細胞組成架構復雜[4]，只有細胞破碎才能獲得細胞內部的高附加值產物。不同的細胞破碎工藝對小球藻造成的破壞程度也不同，直接影響到目的產物的提取效率和產量。同時，不同的小球藻細胞破碎工藝會出現環保、能耗等不同的問題，因此需要根據小球藻產品來選擇合適的細胞破碎工藝。

小球藻細胞進行高附加值產物提取后的殘渣仍然含有豐富的糖類、蛋白類等營養物質，直接舍棄不僅污染環境還會造成不必要的浪費，而沼氣發酵能夠有效降解其它發酵過程不能利用的富余營養物質。近年來，各類大中型沼氣工程的建設，實現了廚余垃圾、秸稈等廢棄物的降解，不僅改善了生態環境，還生產了大量沼氣這一清潔能源為民所用，是進行生態環境重建的重要舉措[5]。通過沼氣發酵進一步利用小球藻的廢液和藻渣，已經成為科研人員探索的一種新思路。本文通過對異養小球藻藻渣產沼氣工藝進行研究，對比探討不同的小球藻破壁方式對藻渣沼氣生產的分解階段和產沼氣能力的影響，從而獲得藻渣產沼氣的最佳預處理工藝參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

異養小球藻：異養培養的原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)，由河南天冠集團車用生物燃料國家重點實驗室提供，細胞內油脂含量高達50%以上；

異養小球藻培養液：取自車用生物燃料國家重點實驗室，原始小球藻質量體積濃度為120 g·L-1；

異養小球藻采用各種提取方法提取后的藻液：取自車用生物燃料國家重點實驗室，存于展示柜中備用；

接種用污泥：取自天冠集團技術中心，TS為1%，在水浴鍋中50 ℃活化1 d備用；

其它試驗材料包括玻璃器皿、試劑等均外購。

1.2 試驗設備

厭氧發酵系統：自制，主要由恒溫水浴鍋、發酵罐、集氣瓶和集水瓶組成。發酵罐、集氣瓶、集水瓶均為l L廣口瓶，采用膠塞密封，發酵罐置于恒溫水浴鍋中，發酵罐口設料液取樣口及導氣管，導氣管連接集氣瓶和集水瓶，具體見圖1。

圖1 沼氣發酵裝置示意圖

沼氣發酵和預處理工藝中所用設備均為外購，主要有上海精密DK-600型恒溫水浴鍋、上海皓莊LNB2.5-10F型馬弗爐、梅特勒FE20-FiveEasy Plus型pH計，上海博珍202-2型電熱恒溫干燥箱，深圳昌鴻QCOD-3E型COD測定儀，深圳昌鴻NH-6N型氨氮測定儀，長沙湘儀L400型離心機，瑞士步琦R-300型旋轉蒸發儀，安捷倫2100型液相色譜儀，武漢四方光電科技Gasboard-3200P 沼氣分析儀等。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料制備方法

培養液藻渣[6]：取異養小球藻培養液藻渣，藻渣油脂含量51.3%。

球磨破碎提油后殘渣[7]：異養小球藻培養液使用球磨法進行細胞破碎、提油后余藻渣備用，藻渣油脂含量7.9%。

酶解提油后殘渣[8]：異養小球藻培養液使用酶解法進行細胞破碎、提油后余藻渣備用，藻渣油脂含量25.8%。

酸熱法破碎提油后殘渣[9]：異養小球藻培養液使用酸熱法進行細胞破碎、提油后余藻渣備用，藻渣油脂含量0.1%。

酯化提柴油后殘渣[10]：異養小球藻培養液原位轉酯化法制備生物柴油后余藻渣備用，藻渣油脂含量0.1%。

1.3.2 原料處理方法

異養小球藻培養液及采用各種提取方法提油后的藻液，使用離心機離心制成藻渣后，取10 g置于烘箱中測100 ℃干重；取藻渣置于廣口瓶中，加入接種用污泥，配成干重為10%的沼氣發酵液。

1.3.3 沼氣發酵方法

取1000 mL沼氣發酵液置于發酵罐中，沼氣發酵溫度為50 ℃，每天搖動發酵罐，每周取樣送檢并補充集氣瓶中水，使用排水法計算排氣量[11]，其中一個發酵系統連續兩周停止產氣后，整個試驗停止。

1.3.4 檢測方法

排氣量：直接用量筒量取集水瓶中水的體積；pH值：直接使用pH計檢測；揮發性脂肪酸：使用液相色譜儀檢測乙酸、丙酸等成分含量，然后加總；碳源：使用液相色譜儀檢測葡萄糖、木糖等成份含量，然后加總；氨氮：使用氨氮檢測儀檢測；COD：使用COD檢測儀檢測；甲烷含量：使用Gasboard-3200P 沼氣分析儀檢測。

1.3.5 計算公式

計算公式如下：

干重(g·L-1)=[藻渣烘干后重量(g)/藻渣體積(mL)]×100

2 試驗結果

2.1 不同原料發酵體系pH值變化情況

使用不同預處理工藝原料各發酵體系的pH值變化情況如圖2。

從圖2可以看到，隨著發酵的進行，5個發酵體系中，使用球磨法、酯化法、酶解液和培養液為原料的4個發酵體系的pH值快速下降，在達到穩定狀態后又小幅回升，而使用酸熱法原料的發酵體系則一直處于下降趨勢中。

圖2 pH值變化圖

2.2 不同原料發酵體系變化情況

在使用不同預處理工藝原料的發酵體系中，氮的平衡是非常重要的因素[12]，不同預處理工藝產生的殘渣由于細胞破碎程度不同，可利用程度也差異較大。小球藻殘渣的初始溶解性有機氮的含量及在發酵過程中的變化趨勢詳見圖3。

圖 變化圖

從圖3可以看出，酯化制柴油后的藻渣作為原料時，其氨氮一直處于較高的水平，培養液、酶解原料最初氨氮為0，然后快速上升，20 d后又迅速下降，球磨、酸熱原料氨氮一直處于較低的水平。

2.3 不同原料發酵體系COD變化情況

COD即化學需氧量[13]，是沼氣發酵中的重要參數，使用不同預處理工藝原料的發酵體系中，其COD變化情況如圖4。

從圖4可以看出，COD的整體變化趨勢是先降低，再升高，然后再降低。其中，球磨法原料所在的發酵體系COD一直處于較高的水平，且在發酵的前48 h遠遠高于其它原料所在發酵體系。而其它原料所在的發酵體系COD一直處于較低的水平，在300000 mg·L-1以下波動。發酵結束后5種原料的發酵體系COD均高于150000 mg·L-1。

圖4 COD變化圖

2.4 不同原料發酵體系總碳含量變化情況

不同預處理工藝原料的發酵體系中的總碳含量的變化情況詳見圖5。

圖5 總碳變化圖

從圖5可以看出，酸熱法原料所在的發酵體系中總碳含量一直處于較高的水平，而培養液、酶解法原料所在的發酵體系中總碳含量先快速上升，然后又快速下降，酯化法、球磨法原料所在的發酵體系中總碳含量一直處于較低的水平。

2.5 不同原料發酵體系VFA含量變化情況

使用不同預處理工藝原料的發酵體系中，其可揮發性脂肪酸含量的變化情況詳見圖6。

從圖6可以看出，球磨法、酸熱法、酯化法原料所在的發酵體系中VFA一直處于較低的水平，且比較平衡，而培養液、酶解液所獲得原料所在的發酵體系中VFA先快速升高，又下降，但整個發酵過程中培養液、酶解法所獲得原料的VFA含量一直高于其它原料所在的發酵體系。

2.6 不同原料發酵體系累積產氣量變化情況

沼氣是沼氣發酵的最終目的，產氣量的高低反映了沼氣發酵體系的生產能力，以及原料的利用能力。采用不同預處理工藝原料的發酵體系，其產氣量的變化情況詳見圖7。

圖6 VFA變化圖

圖7 累積產氣量變化圖

從圖7可以看出，酸熱法原料所在的發酵體系產氣量最高，接近8000 mL，然后依次是球磨法、酶解法、酯化法、培養液。培養液、酶解法原料所在的發酵體系產氣量最低，不足1000 mL。球磨法、酯化法原料所在的發酵體系產氣量處于中間水平。

2.7 不同預處理工藝的發酵體系所產沼氣中 CH4含量的變化情況

試驗通過 Gasboard-3200P 沼氣分析儀對甲烷含量進行測定[14]，精確度為0.1%。試驗分別在發酵的第14，27，41 天測CH4含量，具體數據如表1所示。總體來看，各原料所產沼氣中的CH4含量均隨著發酵時間的延長而升高，說明發酵原料逐步分解，步入了甲烷化階段，此階段的甲烷菌活性較強。酸熱法所產的沼氣CH4含量是最高的，第41天高達70.10%，平均甲烷含量為57.20%。

3 分析與討論

3.1 不同預處理工藝對pH值的影響

結構復雜的大分子有機質無法直接被沼氣細菌利用，需要經過水解作用分解成小分子有機質，然后進一步經過酸化作用分解成沼氣細菌能夠利用的短鏈有機酸。

表1 不同預處理工藝的發酵體系所產沼氣中 CH4含量的比較 (%)

但水解過程、酸化過程和產沼氣過程需要均衡進行。如果水解過程和酸化過程超過了產沼氣過程的反應速度，就會導致產酸過量，從而引起pH值降低，沼氣菌就需要更多能量從細胞體內向體外提供質子以維持其細胞質的生長環境[15]。因此有必要了解pH值的變化規律，以提高沼氣發酵效率。

從圖2的pH值變化中可以看到，隨著發酵的進行，使用球磨法提油、酯化法制柴油、酶解液提油獲得的3種原料和培養液原料4個發酵體系的pH值首先快速下降，在達到穩定狀態后又小幅回升。而使用酸熱法提油原料的發酵體系則一直處于穩步下降趨勢中。

由于預處理工藝對原料結構造成不同的影響，球磨法、酯化法、酶解法3種原料的細胞受到破壞程度有限，與培養液原料差別不大。在發酵初期，受到破壞并成為細胞碎片的部分能夠被水解菌和產酸菌利用，從而使水解菌和產酸菌活躍，加速了水解、酸化進程，反映在pH值上就是pH值快速下降，而在水解過程和酸化過程將能夠快速利用的有機質利用完成后，藻細胞需要慢慢被分解，從而維持pH值平衡狀態。隨后短鏈有機酸被逐漸消耗，pH值緩慢上升。而對于酸熱法獲得的原料，由于細胞破壞完全，原料基本都是細胞碎片[9]，因此整個沼氣發酵過程的水解和產酸都比較旺盛，從而使pH值一直處于穩步的下降狀態。

3.2 不同預處理工藝對的影響

對于固體有機物，沼氣發酵體系首先要將其分解為能溶于水、能夠被酸化細菌利用的小分子有機質，因此，溶解性有機氮的變化趨勢能夠反映沼氣發酵體系對底物的利用情況[11]。

3.3 不同預處理工藝對COD的影響

COD是指處理樣品時，所消耗的強氧化劑的數量，代表了樣品中能夠被氧化的有機物質數量。通常情況下，小分子有機物能夠被完全氧化，大塊的復雜有機物由于難以被強氧化劑完全破壞只是被部分氧化。能夠被氧化的有機物通常能夠被沼氣發酵細菌利用，因此COD可以反映反應體系中底物濃度的高低。

從圖4的COD變化中可以看出，COD的整體變化趨勢是先降低后升高，然后再降低，說明隨著底物被分解、酸化、產甲烷這一過程，底物濃度降低，從而引起COD有所降低。而水解細菌的活動又不斷將不能利用的底物進一步分解成小分子有機物，從而導致COD又有所升高。但分解、酸化、產甲烷始終是一個動態的平衡的體系，因此COD的變化趨勢雖然波動較大，但一直處于一個平衡的區間。

在5種原料中，球磨提油后原料所在的發酵體系COD一直處于較高的水平，說明球磨后形成的細胞碎片能夠不斷被分解。而培養液、酶解液原料所在的發酵體系COD一直處于較低的水平，說明小球藻細胞難以被分解。酸熱法、酯化法獲得的兩種原料，由于細胞在強硫酸作用下已經被破壞，細胞結構中的淀粉、蛋白質被強酸在高溫下碳化無法再通過沼氣發酵水解出更多營養物質，所以其所在發酵體系的COD也一直處于較低的水平。

發酵結束后，五種原料的發酵體系COD均高于150000 mg·L-1，這可能是未被利用的細胞以及在提油時殘留的有機溶劑，說明發酵體系中留存的細胞碎片以及其它有機溶劑雖然影響了COD，但不能被沼氣細菌利用。

3.4 不同預處理工藝對總碳含量的影響

復雜的大塊的有機物難以被沼氣細菌直接利用，在分解過程中被水解菌群分解為能夠被酸化細菌利用的糖類、醇類，總碳含量反映了糖類和醇類的總和，其含量高低能夠說明分解過程進展情況。

從圖5的總碳含量變化中可以看出，酸熱法獲得原料所在的發酵體系中總碳含量一直處于較高的水平，說明酸熱法對小球藻細胞破壞比較徹底，能夠被水解細菌徹底利用。

培養液、酶解法獲得原料所在的發酵體系中總碳含量先快速上升，然后又快速下降，說明培養液、酶解法所獲得原料不能被水解細菌快速分解，其利用有一定過程。在此過程中酸化細菌不能獲得足夠的營養物質而活性受限，隨著分解過程的進行，酸化細菌能夠獲得的營養物質越來越多，活性增強，逐步超過水解細菌分解能力，導致總碳含量快速下降。

酯化法、球磨法獲得原料所在的發酵體系中總碳含量一直處于較低的水平，說明水解細菌、酸化細菌在發酵過程中形成了動態平衡，發酵體系比較穩定，但這兩種原料通過分解獲得的營養物質偏少。

3.5 不同預處理工藝對VFA含量的影響

酸化細菌利用分解過程中產生的小分子有機物，從而產生了乙酸、丙酸、丁酸等可揮發性脂肪酸，這些短鏈脂肪酸能夠被甲烷細菌直接利用從而產生沼氣。VFA含量可以代表乙酸、丙酸等可揮發性脂肪酸含量的多少，也能夠說明酸化過程進展情況[17]。

從圖6的VFA變化中可以看出，球磨法、酸熱法、酯化法所獲得原料所在的發酵體系中VFA一直處于較低的水平，且比較平衡，說明酸化過程、產甲烷過程形成了動態平衡，沼氣發酵比較穩定。

相對于其它原料反應體系，培養液、酶解液所獲得原料所在的發酵體系中VFA先快速升高，又下降，結合圖5，可以說明這兩種原料的細胞壁受到破壞程度低、不能快速被分解細菌直接利用，因此酸化細菌前期受到抑制，產酸較少。但隨著分解過程的進行，仍有部分大分子有機物被分解成能夠被酸化細菌利用的營養物質，從而導致酸化細菌活性增強，產酸快速增加，引起VFA含量的提高。只是分解過程較為緩慢，不能滿足快速增加的酸化細菌營養需求，導致產酸減少，VFA含量降低。

3.6 不同預處理工藝對產氣量的影響

從圖7的產氣量變化中可以看出，酸熱法獲得原料所在的發酵體系產氣量最高，接近8000 mL，然后依次是球磨法、酶解法、酯化法、培養液。

4 小結

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