兩步預處理對厭氧消化產酸纖維酶解和沼氣發酵的影響

王殿龍　吳　波　艾　平　辛　婭　何明雄　張衍林

(1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院， 淮安 223003； 2.江蘇省生物質轉化與過程集成重點實驗室， 淮安 223003；3.農業部沼氣科學研究所生物質能技術研究中心， 成都 610041； 4.華中農業大學工學院， 武漢 430070)

0　引言

隨著化石能源的消耗和能源需求的不斷增加，生物質能源已經受到世界各國的重視[1]，其研究廣泛，工藝技術日趨成熟[2]。生物質能源主要以農作物秸稈和畜禽糞便為原料，在解決環境問題的基礎上，生產沼氣和纖維乙醇等[3-4]。為了提高能源品質，目前已有研究利用厭氧發酵手段生產揮發性脂肪酸[5]，以揮發性脂肪酸為中介制取高值化烴類能源。揮發性脂肪酸生產周期短，產量高[6]，但存在木質纖維素利用率低的特點，其主要降解了半纖維素，導致大量富含纖維素的沼渣產生，此類沼渣稱為厭氧消化產酸纖維。

為了實現生物質有機碳的全效利用，以厭氧消化產酸纖維為原料生產其他生物基產品顯得尤為重要。目前，已有研究開展了對厭氧消化纖維生產乙醇的探索[7]，MACLELLAN等[8]利用玉米芯和豬糞混合發酵后得到的沼渣進行糖化制取乙醇，實現了甲烷和乙醇的聯產，增加了纖維利用率和能源產量。針對厭氧消化纖維，本課題組前期的研究中對比了酸堿預處理，結果表明堿預處理厭氧消化纖維的乙醇產量較高，研究也證明厭氧消化纖維可進一步糖化生產生物基產品[9]。將厭氧消化產酸纖維用于糖化生產乙醇和進一步生產沼氣，不但提供了揮發性脂肪酸生產中大量沼渣利用的新途徑，而且也實現了生物質資源的全效利用，拓展了秸稈能源轉化產業鏈，可構建“揮發酸-乙醇”或“揮發酸-沼氣”聯產的農作物秸稈能源轉化模式。

對于木質素纖維原料的預處理措施中，酸、堿等化學方法具有處理效率高的優點，有效提高纖維素酶解糖化效率[10-12]。針對不同的原料，預處理方法的選取對纖維轉化效率具有重要影響。與強酸相比，有機酸預處理具有較優的木質素溶解性能、高的半纖維素降解率和易于回收等特點；氨水預處理可選擇性地與木質素中的酯鍵和醚堿反應[13]，導致木質素降解，同樣氨水處理成本低，易回收。

基于此，本文首先在實驗條件下制取厭氧消化產酸纖維，分析厭氧消化產酸纖維組分特性，采用乙酸氨水兩步預處理手段，考察預處理過程中的木質纖維素降解特性，研究預處理對厭氧消化產酸纖維酶解糖化效率的影響，同時也探究預處理對厭氧消化產酸纖維產沼氣潛力的影響，分析沼氣產率和總固體去除率，并利用模型分析產氣特性，最后進行質量平衡分析，為厭氧消化產酸纖維的糖化和產沼氣利用提供參考。

1　材料和方法

1.1　厭氧消化產酸纖維制備

稻秸取自華中農業大學水稻田，自然風干后粉碎備用；接種污泥取自華中農業大學正常運行的以豬糞為發酵原料的戶用沼氣池，調節接種污泥的pH值為5.5，分別按照3%和1%的比例加入豬糞和葡萄糖馴化14 d。

根據前期產酸實驗結果，厭氧消化產揮發性脂肪酸過程中采用1%質量分數的氫氧化鈣預處理稻秸，按照10 mL/g的液固比于121℃下預處理1 h，預處理完成后，將預處理的秸稈在35℃條件下發酵10 d，接種率為10%，發酵質量分數為10%。經測定，揮發性脂肪酸質量濃度為14 g/L，揮發性脂肪酸轉化率達到0.25 g/g。發酵結束后收集厭氧消化產酸纖維，在50℃下干燥備用。稻秸、接種污泥和厭氧消化產酸纖維的總固體、揮發性固體和木質纖維素特性見表1。

表1實驗原料的特性

Tab.1Characteristicsofexperimentalmaterials %

參數 數值稻秸馴化污泥厭氧消化產酸纖維總固體質量分數86.8910.79-揮發性固體質量分數74.433.5078.65纖維素質量分數34.9918.1644.19半纖維素質量分數26.029.4013.54木質素質量分數3.566.379.72灰分質量分數3.253.315.41

1.2　厭氧消化產酸纖維的兩步預處理

厭氧消化產酸纖維先采用4%質量分數的乙酸在121℃下預處理2 h，液固比為10 mL/g；乙酸預處理完成后分別采用5%、10%和15%質量分數的氨水在121℃下預處理1 h，預處理完成后，固體樣品經洗滌干燥后進行組分測定、酶解和沼氣發酵。預處理設置兩組對照，分別為單獨乙酸預處理和單獨氨水預處理。

1.3　酶解

取預處理后樣品3 g，加入47 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(50 mmol/L，pH值4.8)使固體質量分數為6%。纖維素復合酶(β-葡聚糖酶活力大于等于6×104U，纖維素酶活力大于等于600 U，木聚糖酶活力大于等于1×105U)來自寧夏和氏壁生物技術有限公司，在150 r/min和50℃下酶解48 h，每隔24 h取液樣分析糖濃度。

1.4　沼氣發酵

沼氣潛力測試采用150 mL發酵瓶，加入3 g預處理后的厭氧消化產酸纖維和60 g新鮮未馴化的接種污泥，通過添加蒸餾水調節總發酵質量分數為8%，初始pH值為7.0，厭氧發酵溫度為35℃。實驗設置污泥對照和未預處理厭氧消化產酸纖維對照，發酵過程中監測日產氣量和氣體成分。

1.5　檢測方法

總固體質量分數采用105℃干燥24 h，揮發性固體質量分數采用550℃灰化4 h，差重法測定；木質纖維素成分采用ANKOM A2000i型全自動纖維分析儀(美國)，根據范式洗滌法測定；葡萄糖和木糖濃度采用安捷倫1220型液相色譜儀測定，Zorbax碳水化合物分析柱，示差折光檢測器，柱溫和檢測器溫度為35℃，流動相為75%乙腈，流速為0.8 mL/min；沼氣氣體成分采用GC9790II 型氣相色譜儀(中國浙江)測量，檢測器為TCD，分析柱為5A分子篩不銹鋼填充柱和Hayesep Q填充柱，柱箱溫度50℃，進樣口溫度為100℃，檢測器溫度為55℃，載氣為氬氣。

2　結果與討論

2.1　厭氧消化產酸纖維的預處理特性

稻秸經過厭氧消化產揮發酸后，半纖維素含量降低，纖維素和木質素含量增加，表明厭氧發酵產揮發酸主要利用半纖維素，而且由于揮發酸對半纖維素的進一步降解作用，使得厭氧消化產酸纖維素具有較低的半纖維素質量分數，為13.54%。厭氧消化纖維中纖維素含量較高，有利于酶解產糖和生產沼氣。針對厭氧產酸纖維中較高的木質素含量，分別考察了乙酸預處理、氨水預處理和乙酸氨水聯合預處理對木質纖維素的降解效果。

圖1　預處理對厭氧消化產酸纖維木質纖維素含量的影響Fig.1　Effect of pretreatment on lignocellulose content of anaerobically digested fiber from VFAs production

從圖1中可以看出，乙酸預處理進一步去除了厭氧產酸纖維中的半纖維素，但去除效果不顯著，半纖維素質量分數降低至11.94%；由于乙酸對木質素降解作用較小，因此乙酸預處理后纖維素含量明顯增加。與單獨乙酸預處理不同的是，氨水預處理對半纖維素的降解略強，而且對木質素的去除有一定作用。但單獨氨水預處理對厭氧消化產酸纖維的木質素脫出效果不顯著，這主要是因為厭氧消化后，纖維變得更難降解，針對這種難降解厭氧消化纖維，提出了乙酸氨水兩步預處理，在結構上破壞木質素，增加纖維素酶和厭氧發酵菌群對纖維素的接觸面積，促進木質纖維素的利用[14]。兩步預處理進一步加強了半纖維素的降解，使得纖維素含量增加，其中10%氨水處理組，纖維素質量分數達到56.82%，半纖維質量分數僅為7.94%。隨著氨濃度的增加，纖維素和半纖維素含量降低，木質素含量升高。

圖2　預處理對厭氧產酸纖維木質纖維素回收率的影響Fig.2　Effect of pretreatment on lignocellulose recovery rate of anaerobically digested fiber from VFAs production

木質纖維素含量體現了預處理后厭氧消化纖維的組分特性，為了更深入地闡明兩步預處理對纖維素和半纖維素的降解效果和后續纖維的利用，考察了木質纖維素的回收率，如圖2所示。可以看出，單獨乙酸預處理和氨水預處理的纖維素回收率較高，分別為92.56%和87.96%，經過乙酸和氨水兩步預處理后，纖維素回收率仍較高，為77.47%～81.44%，這有利于纖維素的利用。對于半纖維素，單獨氨水預處理比單獨乙酸預處理的半纖維素回收率低，即氨水預處理的半纖維素降解更強，這主要是由厭氧產酸纖維的特性引起的，一方面厭氧產酸纖維已經經過有機酸的處理，另一方面大量半纖維素已經在厭氧產酸階段降解[15]，氨水處理的脫木質素能力可進一步導致半纖維素降解。重要的是，乙酸氨水兩步預處理后的半纖維素回收率為33.29%～37.78%，均明顯低于乙酸處理對照和氨水處理對照，而且隨氨濃度的增加，半纖維素回收率逐漸降低，這表明兩步預處理對難降解的厭氧產酸纖維有著較好的降解作用。從木質素回收率上看，乙酸單獨預處理對木質素脫出作用較弱，木質素回收率達95.39%，單獨氨預處理表現出了一定的木質素去除能力，木質素回收率為74.18%，而兩步預處理在木質素的脫出效果上更為顯著，其中乙酸聯合10%氨水預處理組的木質素回收率僅為55.85%，去除了較多的木質素，有利于纖維素的酶解和發酵。當氨水質量分數為15%時，木質素回收率反而增高，這可能是由降解過程中產生有機抑制物導致的[16]。綜上，兩步預處理對半纖維素和木質素的降解作用得到強化，對纖維素的回收效果顯著。

2.2　兩步預處理對厭氧消化產酸纖維酶解特性的影響

為了考察兩步預處理對厭氧消化產酸纖維的處理效果，分析了不同處理下的厭氧消化產酸纖維酶解后的葡萄糖和木糖質量濃度，見表2。未經過處理原始稻秸酶解48 h的葡萄糖質量濃度為23.31 g/L，木糖質量濃度僅為2.49 g/L，這是由于未處理的稻秸結構致密，受到木質素的包裹使得酶解效率較低。厭氧產酸后的稻秸葡萄糖質量濃度明顯提高，可見厭氧產酸過程不僅可以生產揮發酸，而且可以作為一種厭氧處理手段；而木糖含量仍較低，這也體現出厭氧消化產酸階段主要降解的是半纖維素。

表2　酶解過程中葡萄糖和木糖質量濃度變化Tab.2　Changes in glucose and xylose concentrations during enzymatic hydrolysis　g/L

高溫乙酸預處理后，葡萄糖和木糖質量濃度略有增加，而單獨氨水處理后，葡萄糖質量濃度無明顯變化，而木糖質量濃度較高，這是因為氨處理過程中不僅去除了木質素，增強了半纖維素的水解，而且也去除了部分纖維素，使得葡萄糖質量濃度沒有增加。乙酸氨水兩步預處理組的葡萄糖質量濃度顯著升高，其中10%氨水實驗組葡萄糖質量濃度最高，為47.46 g/L，這表明乙酸預處理后的纖維再經過氨水處理時，纖維素的降解被緩解，相比單獨氨水處理提高了纖維素的酶解糖化效率，這也驗證了前面預處理過程中的木質纖維素降解機理。

2.3　兩步預處理對厭氧產酸纖維沼氣發酵性能和木質纖維素降解的影響

預處理對厭氧消化產酸纖維的產沼氣潛力的影響如圖3所示，與未處理的厭氧消化產酸纖維相比(287 mL/g)，單獨乙酸和單獨氨水預處理后，沼氣產率沒有明顯提高，單獨乙酸預處理促進半纖維素的降解，導致沼氣產率略有下降；單獨氨水預處理后的沼氣產率為304 mL/g，表明木質素的去除有利于提高沼氣產量[17]。因此，基于前面兩步預處理對木質素的去除效果，兩步預處理后的厭氧消化產酸纖維沼氣產率大幅提高，乙酸聯合5%氨水和15%氨水預處理組的沼氣產率與未處理組相比分別提高了25.09%和28.92%；乙酸聯合10%氨水預處理組的沼氣產率最高，為414 mL/g，相比未處理組，沼氣產率提高了44.25%，表明乙酸氨水兩步預處理可有效提高厭氧消化產酸纖維的沼氣產率，實現了生物質木質纖維素的全效利用。

圖3　預處理對厭氧消化產酸纖維沼氣發酵潛力的影響Fig.3　Effect of pretreatment on biogas potential of anaerobically digested fiber from VFAs production

平均甲烷質量分數和總固體去除率如表3所示(Rm表示最大產沼氣速率，λ表示延遲時間，Ps表示模擬的沼氣產率，Rs表示模擬的產沼氣速率)，與原始厭氧消化產酸纖維相比，預處理后發酵的平均甲烷產量略高，各組間相差不大；總固體去除率是評價厭氧發酵過程的一個重要指標[18]，未處理組的總固體去除率為29.40%，與其他研究相比略高，這是因為厭氧發酵產酸過程也具有一定的預處理效果。單獨乙酸和氨水預處理組的總固體去除率較高，分別為40.50%和42.67%，可見厭氧消化產酸纖維的預處理特性明顯不同于原始稻秸；而兩步乙酸氨水預處理組的總固體去除率規律明顯，氨水濃度越高，總固體去除率越高，結合產氣和木質纖維素含量分析可知預處理過程中木質素去除越多，發酵后總固體去除率越高，即：兩步預處理獲得的可發酵纖維素和半纖維素含量較高。

2.4　沼氣發酵過程的修正Gompertz模型參數

采用修正的Gompertz 模型描述厭氧發酵過程[19]，模型公式為

式中H——t時刻的累積沼氣產量，mL

P——沼氣產量的潛力，mL

表3　修正Gompertz的模型參數Tab.3　Model parameters of modified Gompertz equation

Ps和Rs分別通過P和Rm除以發酵原料質量得到。該模型主要用來擬合最大產沼氣速率、累積沼氣產量和延遲時間。通過對模型公式求導令結果為零，就可以得到最大的甲烷產率。P、Rm和λ是通過擬合得到的，其中λ可作為評價啟動快慢的重要指標。模型參數結果見表3，可以看出，乙酸聯合10%氨水預處理組模擬沼氣產率最高，為399 mL/g，最大產沼氣速率為3.76 mL/(g·h)，而且延遲時間均較短，表明厭氧消化產酸纖維是一種合適的發酵原料，兩步預處理有利于提高沼氣產量，與單獨乙酸和單獨氨水預處理組相比，兩步預處理效果顯著，提高了纖維的轉化效率。

2.5　預處理、酶解和沼氣發酵過程質量平衡

基于100 g厭氧消化產酸纖維作質量平衡分析(圖4)，經過厭氧消化后的沼渣中含有44.19 g的纖維素，半纖維素質量僅為13.54 g。乙酸預處理后，纖維損失20.56 g，其中纖維素損失3.3 g，半纖維素損失4.05 g，木質素含量基本沒有變化；乙酸處理后的纖維再經過10%氨水預處理，總質量損失21.70%，纖維素質量仍較高，為35.34 g，半纖維素質量僅為4.94 g，同時去除了較多的木質素，增加了纖維的孔隙度和接觸面積，有利于與纖維素復合酶及厭氧微生物的接觸。酶解糖化結果獲得了33.22 g葡萄糖，基于厭氧消化產酸纖維計算，葡萄糖水解得率達到67.73%；兩步預處理的纖維厭氧發酵后可獲得25.8 L沼氣。質量平衡分析更加清晰地闡明了兩步乙酸氨水預處理厭氧消化產酸纖維過程的纖維素和半纖維素降解機理。

圖4　兩步預處理厭氧產酸纖維產糖/產沼氣全過程質量平衡Fig.4　Mass balance in two-step pretreatment for sugar or biogas production with anaerobically digested fiber from VFAs production

2.6　厭氧消化產酸纖維產糖產沼氣參數對比

表4對比了稻秸、厭氧消化纖維和厭氧消化產酸纖維在不同預處理方法下的酶解葡萄糖得率和厭氧發酵的沼氣產率，從沼氣產率上來看，乙酸預處理比硫酸和水熱處理條件下的沼氣產率較高，乙酸和氨水的兩步預處理能進一步提高厭氧消化產酸纖維的沼氣產量，總固體產氣率達到414 mL/g；對于葡萄糖得率，稀酸預處理應用較為普遍，葡萄糖得率較高，為51.60%，與原始稻秸相比，厭氧消化纖維和厭氧消化產酸纖維由于其是發酵后的沼渣，難于降解，因此其預處理和酶解特性不同于原始稻秸，NaOH預處理可有效提高厭氧消化纖維的酶解糖化效率。本研究基于厭氧消化產酸纖維的獨特性質，采用了乙酸氨水兩步處理方法，葡萄糖得率和沼氣產率均較高，這為揮發性脂肪酸生產過程中的廢渣利用提供了新的途徑和參考。

表4　不同原料和預處理方法的酶解葡萄糖得率和沼氣產率Tab.4　Comparison of glucose conversion and biogas yield of different feedstocks and pretreatments

3　結論

(1)針對厭氧消化產酸纖維采用了乙酸氨水兩步預處理，纖維素回收率為77.47%～81.44%，經過4%乙酸和10%氨水在121℃的連續預處理，纖維素質量分數達到56.82%，經過產酸和兩步預處理后稻秸殘渣中半纖維素質量分數僅為7.94%。

(2)酶解糖化過程中，兩步預處理具有明顯優勢，在最優條件下，葡萄糖質量濃度達到47.46 g/L，基于原始厭氧消化產酸纖維計算，葡萄糖得率較高，為67.73%。

(3)從厭氧發酵的沼氣產率上看，乙酸氨水兩步預處理的沼氣產率明顯優于單獨乙酸和單獨氨水預處理，其中乙酸聯合10%氨水預處理組獲得了最高的沼氣產率，為414 mL/g，有效提高了厭氧消化產酸纖維的產氣效率。

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