香蕉枯萎病菌快速檢測技術(shù)

陳帆

香蕉枯萎病作為一種檢疫性病害，主要侵染帶菌的球莖、病株殘體及帶菌土壤，并隨病株殘體、帶菌土壤、農(nóng)耕工具等進行傳播，嚴(yán)重影響我市香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究運用雙重抑菌法，對采自漳州各地蕉園的香蕉組織和土壤樣本進行處理，以達(dá)到快速檢測香蕉枯萎病菌4號生理小種的目的。同時，通過鑒定菌落形態(tài)及ITS-SCAR檢驗確定標(biāo)的菌。

1 檢測材料與方法

1.1 采樣地點及樣本類型

土壤樣本來自漳州市赤湖、天寶鎮(zhèn)后寨村、薌城區(qū)浦南鎮(zhèn)松洲村等地香蕉園。

1.2 土壤懸浮液中選擇性抑菌劑的確定

把采集的土壤樣本配制成土壤懸浮液，分別加入0.1 g.L-172 %甲霜靈、50 %異菌脲、25 %咪鮮胺、40 %睛菌唑、25 %三唑酮和70 %惡霉靈作為土壤懸浮液中;同時分別加入0.1 g.L-1硫酸鏈霉素（Streptomycin Sulfate）作為細(xì)菌抑菌劑。以未添加殺菌劑的土壤懸浮液以為對照。將混有不同抑菌劑的土壤懸浮液涂布在KM培養(yǎng)基上，7 d后觀察菌落生長情況。

1.3 土壤懸浮液中抑菌劑最適濃度的選擇

將1.2實驗中篩選出的抑菌劑F1，采用黃金分割法稀釋0.618倍、0.6182 倍、0.6183倍，配制成抑菌劑F2、抑菌劑F3、抑菌劑F4，將含有4種不同濃度抑菌劑的土壤懸浮液分別涂布在KM培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)， 7 d后觀察菌落生長情況（表1-1）。

1.4 土壤懸浮液中抑菌劑作用時間的確定

將混有最佳抑菌濃度的土壤懸浮液分別靜置10 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min，在KM培養(yǎng)基上均勻涂布每一時間段的土壤懸浮液，觀察菌落生長情況和顏色特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤懸浮液中抑菌劑篩選

試驗結(jié)果顯示：硫酸鏈霉素分別和咪鮮胺、三唑酮組成的抑菌劑A和抑菌劑B對標(biāo)的菌和非標(biāo)的菌均有很強的抑制作用（圖2-1，A-B）。硫酸鏈霉素分別和異菌脲、和睛菌唑、惡霉靈組成的抑菌劑C、抑菌劑D和抑菌劑E難以分離出標(biāo)的菌且仍有少量非標(biāo)的菌生長（圖2-1，C-E）。而硫酸鏈霉素和甲霜靈組成的抑菌劑F在KM培養(yǎng)基中分離出的菌落較為單一，生物學(xué)特征明顯（圖2-1，F(xiàn)）。可見：在土壤懸浮液中添加由甲霜靈和硫酸鏈霉素組成的抑菌劑F可有效分離出香蕉枯萎病菌4號生理小種且抑制了其他雜菌的干擾。

2.2 土壤懸浮液中抑菌劑最適濃度的確定

在KM培養(yǎng)基上涂布含有不同濃度抑菌劑的土壤懸浮液，試驗結(jié)果顯示：抑菌劑F1和抑菌劑F2在培養(yǎng)8d后才長出較少的標(biāo)的菌，且性狀不明顯;抑菌劑F3能夠在3 d內(nèi)長出標(biāo)的菌，且數(shù)量適中，特征明顯。抑菌劑F4由于濃度偏低，標(biāo)的菌和非標(biāo)的菌均有生長（圖2-2）。可見，由甲霜靈0.053g.L-1，硫酸鏈霉素0.115g.L-1組成的抑菌劑F3為最適濃度。

2.3 土壤懸浮液中抑菌劑作用時間的確定

在 KM培養(yǎng)基上均勻涂布含有抑菌劑F3的土壤懸浮液，靜置10-40 min，由于時間較短，標(biāo)的菌落數(shù)較多、較小，形態(tài)特征不明顯，且尚有非標(biāo)的菌生長;靜置60 min，可促進標(biāo)的菌有效生長且性狀明顯，而且強烈抑制了非標(biāo)的菌生長。而靜置80min后菌落數(shù)開始減少，菌落形態(tài)特征不明顯。可見，由甲霜靈0.053g.L-1和硫酸鏈霉素0.115g.L-1組成的抑菌劑F3，對土壤懸浮液處理60 min可顯著提高KM培養(yǎng)基對香蕉枯萎病菌4號小種的選擇性（圖2-3）。

抑菌時間（min）

2.4 KM培養(yǎng)基雙重選擇檢測結(jié)果

試驗結(jié)果顯示：將未含有抑菌劑F3的土壤懸浮液涂布在KM培養(yǎng)基上能分離出香蕉枯萎病菌4號小種，但是菌落較小、特征不明顯，且仍有其他雜菌生長。而采用雙重選擇抑菌法，即在KM培養(yǎng)基上均勻涂布含有抑菌劑F3的土壤懸浮液可檢測出單一的香蕉枯萎病菌4小號種（圖2-4）。

A： KM培養(yǎng)基單抑菌檢測;

B： KM培養(yǎng)基雙重抑菌檢測

2.5 ITS-SCAR檢測

運用雙重抑菌法分離出來的菌落，通過ITS-SCAR檢測確定為香蕉枯萎病菌4號生理小種（圖2-5）。

3 討論

由于前人研制的KM培養(yǎng)基能夠較好分離出單一的香蕉枯萎病菌4號小種，但在實踐中仍易受其他雜菌干擾。為了提高培養(yǎng)基的專化性及靈敏度，通過選擇最適濃度抑菌劑及恰當(dāng)?shù)淖饔脮r間對帶病土壤懸浮液進行處理，既提高了對香蕉枯萎病菌4號小種的選擇性而且有效抑制其他雜菌的生長，達(dá)到了快速檢測的目的。