香蕉枯萎病菌快速檢測技術

陳帆

香蕉枯萎病作為一種檢疫性病害，主要侵染帶菌的球莖、病株殘體及帶菌土壤，并隨病株殘體、帶菌土壤、農耕工具等進行傳播，嚴重影響我市香蕉產業的發展。本研究運用雙重抑菌法，對采自漳州各地蕉園的香蕉組織和土壤樣本進行處理，以達到快速檢測香蕉枯萎病菌4號生理小種的目的。同時，通過鑒定菌落形態及ITS-SCAR檢驗確定標的菌。

1 檢測材料與方法

1.1 采樣地點及樣本類型

土壤樣本來自漳州市赤湖、天寶鎮后寨村、薌城區浦南鎮松洲村等地香蕉園。

1.2 土壤懸浮液中選擇性抑菌劑的確定

把采集的土壤樣本配制成土壤懸浮液，分別加入0.1 g.L-172 %甲霜靈、50 %異菌脲、25 %咪鮮胺、40 %睛菌唑、25 %三唑酮和70 %惡霉靈作為土壤懸浮液中;同時分別加入0.1 g.L-1硫酸鏈霉素（Streptomycin Sulfate）作為細菌抑菌劑。以未添加殺菌劑的土壤懸浮液以為對照。將混有不同抑菌劑的土壤懸浮液涂布在KM培養基上，7 d后觀察菌落生長情況。

1.3 土壤懸浮液中抑菌劑最適濃度的選擇

將1.2實驗中篩選出的抑菌劑F1，采用黃金分割法稀釋0.618倍、0.6182 倍、0.6183倍，配制成抑菌劑F2、抑菌劑F3、抑菌劑F4，將含有4種不同濃度抑菌劑的土壤懸浮液分別涂布在KM培養基上，恒溫培養， 7 d后觀察菌落生長情況（表1-1）。

1.4 土壤懸浮液中抑菌劑作用時間的確定

將混有最佳抑菌濃度的土壤懸浮液分別靜置10 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min，在KM培養基上均勻涂布每一時間段的土壤懸浮液，觀察菌落生長情況和顏色特征。

2 結果與分析

2.1 土壤懸浮液中抑菌劑篩選

試驗結果顯示：硫酸鏈霉素分別和咪鮮胺、三唑酮組成的抑菌劑A和抑菌劑B對標的菌和非標的菌均有很強的抑制作用（圖2-1，A-B）。硫酸鏈霉素分別和異菌脲、和睛菌唑、惡霉靈組成的抑菌劑C、抑菌劑D和抑菌劑E難以分離出標的菌且仍有少量非標的菌生長（圖2-1，C-E）。而硫酸鏈霉素和甲霜靈組成的抑菌劑F在KM培養基中分離出的菌落較為單一，生物學特征明顯（圖2-1，F）。可見：在土壤懸浮液中添加由甲霜靈和硫酸鏈霉素組成的抑菌劑F可有效分離出香蕉枯萎病菌4號生理小種且抑制了其他雜菌的干擾。

2.2 土壤懸浮液中抑菌劑最適濃度的確定

在KM培養基上涂布含有不同濃度抑菌劑的土壤懸浮液，試驗結果顯示：抑菌劑F1和抑菌劑F2在培養8d后才長出較少的標的菌，且性狀不明顯;抑菌劑F3能夠在3 d內長出標的菌，且數量適中，特征明顯。抑菌劑F4由于濃度偏低，標的菌和非標的菌均有生長（圖2-2）。可見，由甲霜靈0.053g.L-1，硫酸鏈霉素0.115g.L-1組成的抑菌劑F3為最適濃度。

2.3 土壤懸浮液中抑菌劑作用時間的確定

在 KM培養基上均勻涂布含有抑菌劑F3的土壤懸浮液，靜置10-40 min，由于時間較短，標的菌落數較多、較小，形態特征不明顯，且尚有非標的菌生長;靜置60 min，可促進標的菌有效生長且性狀明顯，而且強烈抑制了非標的菌生長。而靜置80min后菌落數開始減少，菌落形態特征不明顯。可見，由甲霜靈0.053g.L-1和硫酸鏈霉素0.115g.L-1組成的抑菌劑F3，對土壤懸浮液處理60 min可顯著提高KM培養基對香蕉枯萎病菌4號小種的選擇性（圖2-3）。

抑菌時間（min）

2.4 KM培養基雙重選擇檢測結果

試驗結果顯示：將未含有抑菌劑F3的土壤懸浮液涂布在KM培養基上能分離出香蕉枯萎病菌4號小種，但是菌落較小、特征不明顯，且仍有其他雜菌生長。而采用雙重選擇抑菌法，即在KM培養基上均勻涂布含有抑菌劑F3的土壤懸浮液可檢測出單一的香蕉枯萎病菌4小號種（圖2-4）。

A： KM培養基單抑菌檢測;

B： KM培養基雙重抑菌檢測

2.5 ITS-SCAR檢測

運用雙重抑菌法分離出來的菌落，通過ITS-SCAR檢測確定為香蕉枯萎病菌4號生理小種（圖2-5）。

3 討論

由于前人研制的KM培養基能夠較好分離出單一的香蕉枯萎病菌4號小種，但在實踐中仍易受其他雜菌干擾。為了提高培養基的專化性及靈敏度，通過選擇最適濃度抑菌劑及恰當的作用時間對帶病土壤懸浮液進行處理，既提高了對香蕉枯萎病菌4號小種的選擇性而且有效抑制其他雜菌的生長，達到了快速檢測的目的。