早期介入麥粒灸對轉基因阿爾茨海默病小鼠腦內APP蛋白表達的研究*

高靈愛,包燁華,張永生,楚佳梅

(1.余杭區第五人民醫院，浙江 杭州 311100；2.杭州市中醫院，浙江 杭州 310007；3.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310007)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD) 是威脅人類健康的主要疾病之一，并隨著人類壽命的延長，發病率呈明顯增高趨勢，患者通常在發病后數年內死亡。現代研究證明，阿爾茨海默病的病理始發因素和中心環節是β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)的沉積[1]。β-淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是由Aβ經過β、γ分泌酶依次裂解產生[2-3]。APP表達增加被認為是AD的風險因素之一。現代研究發現，β-APP與AD的發生有密切關系[4]，有研究報道[5]APP可能在抑制AD的發生中發揮重要作用，其在通過LRPI調節腦中apoE代謝及建立APP與apoE之間的生物聯系中APP的γ分泌酶切割發揮著核心作用。APP能夠通過促進神經生長因子產生從而促進軸突生長。APP可以促進突出形成、生長和牽引；APP具有誘導和維持長時程記憶的作用[6]。Stokin等[7]指出過量表達的APP會導致神經元軸突功能損害，且這種損害與Aβ的產生無關。因此，本實驗以中醫“治未病”思想為指導，擬“補腎養心”為治則，利用麥粒灸未病先防、防病傳變及無毒副作用的特點，早期介入麥粒灸治療APP/PS1轉基因小鼠，觀察淀粉樣前體蛋白表達，從而抑制β淀粉樣蛋白的沉積，進一步影響老年斑的形成，最終預防老年癡呆的發生。

1　材料與方法

1.1　動物與分組

由上海生命科學院景乃禾研究員惠贈的1.5月齡的B6SJL-Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/J品系、雙轉基因AD小鼠雜合體種鼠4只，由中科院上海實驗動物中心及上海斯萊克實驗動物有限公司提供[SCXK(滬)2007-0005]配種鼠；以上所用鼠均在浙江中醫藥大學SPF級轉基因實驗動物中心飼養保種并繁衍產生后代，用PCR實驗方法在子鼠出生后3～4周齡時進行轉基因鑒定。

依據符合科技部相關善待實驗動物的倫理學規定處置實驗過程中動物。按隨機數字表將APP/PS1雙轉基因陽性雌性小鼠17只隨機分為兩組，一組9只為模型組，另一組8只為治療組，9只同齡同背景的C57BL/6J陰性雌性小鼠為正常對照組。

1.2　主要試劑及儀器

一抗：兔抗APP(批號bs-0112R，由北京博奧森生物技術有限公司提供)；二抗：鼠抗兔IgG(批號SP-9001，由北京博奧森生物技術有限公司提供)；濃縮型DAB試劑盒(ZLI-9032,批號60882801，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供)；PTC-200 PCR 擴增儀(由Biorad 公司提供)；艾絨：艾灸王(直徑18 mm×200 mm，中國漢醫艾絨)。

1.3　動物模型基因鑒定方法

用PCR實驗方法鑒定APP/PS1雙轉基因小鼠實驗過程，取3周齡子代小鼠鼠尾約0.5 cm入離心管內→加裂解液→56℃轉動過夜→離心后異丙醇混勻→離心沉淀DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢DNA片段→讀取跑膠結果：Tg(APP):轉基因377 bp和野生型324 bp;Tg(PS1):轉基因608 bp和野生型324 bp。結果見圖1。

圖1　電泳結果　　注：M為Marker，其中，1、2、5、6、7、9、11、13、14、17、19、21、22、24、26、28、29為APP/PS1雙轉基因陽性小鼠

檢測出29只雌性子代小鼠取PCR產物長度為Tg(APP) 377 bp和Tg(PS1)608 bp的17只雙轉基因陽性雌性小鼠為本實驗研究對象，隨機分為兩組分別為9只模型組和8只治療組。

1.4　治療方法

本實驗開始之前剔除AD小鼠穴位區域的毛發，參照中國針灸學會實驗針灸分會制定《動物針灸穴位圖譜》、比較解剖學的方法為本實驗小鼠取“心俞”“腎俞”穴。采取人工固定小鼠的方法，分別給實驗組小鼠施行操作，具體方法如下：模型組予抓取固定等刺激和正常組不做任何處理；治療組予提前備好麥粒大小圓錐形艾炷(直徑5 mm×高8 mm)放置“心俞”“腎俞”穴，待艾炷燃燒至3/5時鑷子即去除，每次每穴灸一壯(時間約25 s～30 s)，1次/日，10次作為1個療程，療程之間休息2天，施行9個療程后結束治療。實驗中意外燙傷處理可涂濕潤燒傷膏少許予穴位處；在治療過程中，可能由于轉基因模型小鼠較正常鼠身體素質偏弱，治療組小鼠死亡1只，模型組死亡2只，予以剔除。

1.5　觀察指標及檢測方法

1.5.1組織取材3組實驗小鼠治療結束→腹腔麻醉暴露胸腔→予生理鹽水和多聚甲醛灌注心臟→開顱取腦多聚甲醛固定→常規石蠟包埋→視交叉前后冠狀切片→讀片。

1.5.2尼氏體染色取相鄰部位的腦片→石蠟切片脫臘→蒸餾水洗→放甲苯胺藍水溶液→烤箱孵育→蒸餾水洗→乙醇快速脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片→光學顯微鏡觀察拍照。

1.5.3APP免疫組化取切片→置烤箱烘烤→常規脫蠟至水→微波修復抗原→入枸椽酸鹽緩沖液中置在微波爐中加熱→洗滌阻斷過氧化物酶→PBS洗→滴加稀釋的一抗→孵育(APP為1∶150)PBS洗→滴加二抗→孵育PBS洗→DAB顯色→復染透明后封片→顯微鏡觀察→以切片海馬區和額葉皮層各取6個視野(×400)→采用計算機分析(圖像分析軟件Image Pro-plus5.0)測量陽性面積(area)、總光密度值(Integrated optical density)→數據匯總。

1.6　統計學處理方法

2　結果

2.1　APP/PS1雙重轉基因小鼠腦內額葉皮層及海馬區尼氏體染色觀察早期神經元損傷的情況

尼氏體染色后，光鏡下可見正常組小鼠額葉皮層及海馬區神經元胞核染成藍色，胞漿中尼氏小體呈深藍色，均勻分布于細胞核的周圍。觀察模型組和治療組實驗小鼠切片的海馬區及皮層區尼氏體數量未見明顯減少，神經元形態及排列與正常組比較無明顯差異。提示，5月齡的Tg6799模型小鼠腦內尚未出現明顯的神經元丟失。見封三彩圖2。

2.2　APP/PS1雙重轉基因小鼠腦內額葉皮層及海馬區淀粉樣前體蛋白(APP)沉積的變化

各組小鼠大腦額葉皮層及海馬區可見棕黃色陽性表達，主要位于細胞胞漿和胞膜而細胞核呈陰性。

從鏡下觀察顯示,見封三彩圖3。在模型組大腦額葉皮層、海馬區陽性細胞明顯多，胞漿著色明顯加深，與模型組比較，治療組和正常組陽性細胞數量少，胞漿著色變淺。經統計分析,見表1，與正常組和治療組比較，模型組大腦皮層陽性面積明顯增加，差異顯著(P<0.01)，總光密度值增高(P<0.05或P<0.01)；模型組海馬區陽性面積和總光密度均增高(P<0.05);而治療組和正常組陽性表達相仿，但著色淺明顯低于模型組，無顯著性差異(P>0.05)。

表1　各組小鼠海馬額葉皮層淀粉樣前體蛋白APP表達的比較

注：與模型組比較,*P<0.01，▲P<0.05

3　討論

阿爾茨海默病(AD)是一種漸進的、不可逆轉的神經系統疾病和最常見一種癡呆。目前，世界上有超過3650萬人受到癡呆的影響，其中大多數都是與AD有關。據估計，在老年人群中，每年有500～700萬新發病例。目前臨床沒有任何治療方法來預防或減緩疾病的進展[8-9]。AD的發病及病理過程是一個漫長的過程。大量的研究和臨床實踐表明AD的病理改變過程要早于臨床診斷很多年，在AD發病后，尤其是中晚期，各種治療方法的效果并不理想。“淀粉樣蛋白級聯假說”是由Hardy等[10]學者于1992年提出的，是目前較為公認的AD發病機制學說。該學說所描述的AD病理過程的進展為：APP等基因突變的發生使Aβ的產物增加并發生Aβ的凝集、沉積，之后可繼發性的發生突觸可塑性的破壞、小膠質細胞和星形膠質細胞的活化增生、神經元損傷、神經元內離子穩態改變、tau蛋白過度磷酸化、大量的神經元細胞死亡，最終可導致癡呆。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是與AD的發生、發展密切相關的一類I型跨膜蛋白，具有膜受體樣結構。在生物體內的水解途徑有兩種，其中APP是經β分泌酶和γ分泌酶的順次切割后形成的肽,而淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)被認為是AD主要誘因[11-14]。APP廣泛表達，尤其在神經元中有很高的濃度[15]。Shaked 等[16]提出，Aβ與APP相互作用，Aβ位于APP的疏水部分，具有很強的聚集性，易形成極難溶解的沉淀。經過一系列的級聯反應，最終會引起細胞凋亡；而作用的位點正是APP上的Aβ區域。家族性阿爾茨海默病(FAD) 發生可見APP 基因突變[17]，而APP基因突變導致Aβ的生成和聚合的增加最終轉人類FAD 基因的小鼠可表現為類似人類阿爾茨海默病的癥狀[18]。尼氏小體是神經細胞胞質內的一種物質，與神經細胞的功能密切相關，當神經細胞病變時，尼氏小體的數量減少、位置改變，甚至溶解、消失，是觀察神經細胞損傷的一項指標[19]。

阿爾茨海默病是西醫學病名，祖國醫學傳統理論中雖未出現此病的專門記載，但是根據其相關癥狀、病因、病機，可將其歸為“健忘”“呆病”“善忘”“郁證”“顛證”等范疇。“癡呆”病名始見于漢代《華佗神醫秘傳》。明朝李中梓在《醫宗必讀》記載:“心不下交于腎，則火亂其神明，腎不上交于心，精氣伏而不用，火居上則因而生 ，水居下則因而生燥，擾擾紜紜，昏而不寧。故補腎使之時上，養心使之善下，則神氣清明，志意常治而何健忘之有”,說明心腎陰血虧虛，致水火不濟是健忘癡呆的常見原因。林永淼等[20]認為癡呆發生主要責于心腎，心氣不足腎陽虛衰神明失用、腦失所養為疾病之本。中醫自古有論，《素問·四氣調神大論》提到：“是故圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂，此之謂也”。自古中醫“治未病”的預防思想是中醫養生保健理論的精髓之一。艾灸有防病保健的作用，《扁鵲心書》說：“保命之法，灼艾第一”，古代醫家都提倡用艾灸延緩衰老。有研究報道，艾絨燃燒過程中熱感可穿透機體組織以誘導肌肉生成一類熱激蛋白質最終激發免疫系統，從而起到治病強身健體的作用[21]。另有艾灸通過改善血液循環、調節機體代謝和延緩衰老等功效來達到防病保健的作用[22]。而麥粒灸屬于艾灸療法中的一種，將麥粒大小艾炷，置于腧穴上點燃施灸，當艾炷燃剩2/5至1/4患者皮膚會感到微有灼痛時易炷再灸以規定數壯灸完為結束治療，多以局部皮膚出現紅暈而不起泡為度。

APP/PS1雙轉基因模型小鼠是大多研究學者公認的比較成功的轉基因AD模型，攜帶突變APP和PSl基因的雙轉基因AD模型小鼠能夠模擬AD患者腦內主要的神經病理過程及模擬AD行為學表現和病理學改變。其腦內淀粉樣蛋白沉積部位與人類AD患者相似，主要存在于大腦皮層及海馬。本課題采用B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)是APP/PS1雙轉基因模型的一種，與其它轉基因AD小鼠比較，APP/PS1雙轉基因小鼠有APP高負荷超表達的特征，在1.5月齡小鼠的神經元胞質內可以看到Aβ1-42聚集，2月齡小鼠出現淀粉樣蛋白沉積[23]。

綜上所述，研究表明Tg6799雙轉基因AD小鼠1.5月齡時已表現APP及Aβ1-42的沉積，2月齡時老年斑隨之出現，且隨著年齡的增長其記憶能力越來越差，為了探究麥粒灸能否改善AD癥狀，筆者開始給1.5月齡AD小鼠介入麥粒灸療法，經過9個療程的治療，即AD小鼠5月齡時，通過病理學和基因生物學水平實驗之后，通過對小鼠腦組織切片進行尼氏體染色后發現，正常組、模型組及治療組小鼠海馬區及額葉皮層神經元形態及排列均較整齊，胞漿中尼氏小體呈深藍色，均勻分布于細胞核的周圍，尼氏體數量也均未見明顯減少，表明5月齡的Tg6799小鼠腦內尚未發生明顯的神經元缺失。這與近年來國內外的實驗動物研究結果一致，且和“淀粉樣蛋白級聯假說”提出的AD病理進程中神經元損傷是由于Aβ低聚反應過程中具有神經毒性的產物導致有關記憶形成的信號傳導發生障礙的理論[24]契合。經統計分析，與模型組比較，AD小鼠額葉皮層和海馬區APP的表達明顯減少(P<0.05)。本研究不僅肯定了麥粒灸的療效，也豐富了中醫“治未病”的理念，隨著老齡化人口的增長，有必要進行更深入的研究，不僅探討艾灸治療AD的機制，也要將艾灸“治未病”的理念宣傳教育，應用于更多AD患者。

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