地龍粉酶解用酶初步篩選

呂迎蘭，劉　穎，王彥多，毛會秀，曹廣超，王集會，高世杰*

(1.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南　250355；2.山東中醫藥大學 實驗中心，山東 濟南　250355)

地龍(蚯蚓)是鉅蚓科動物參環毛蚓等的干燥體。李時珍在《本草綱目》中認為其具有通經活絡、活血化瘀、等作用。現代研究表明，地龍具有抗血栓、抗腫瘤、免疫調節、降壓平喘、抗癌等作用[1]。現代藥理研究表明，動物類藥材發揮藥效作用的主要成分為小分子肽[2]。另有研究表明，動物藥在酶解之后其生物活性普遍高于原品[3]。地龍體內含有多肽蛋白質類物質、還原糖、維生素和微量元素等成分[4]，因此，近年來，探究地龍體內的抗腫瘤活性成分一直是地龍研究的熱點。

本課題組擬以地龍粉為底物，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶5種蛋白酶對地龍粉進行水解，同時以地龍粉水提液作為對照組，測定五種蛋白酶水解液的水解度，水解液冷凍干燥后，配制系列濃度的供試品溶液，以對肺腺癌細胞(A549)的抑制率為指標，對五種蛋白酶進行篩選，并初步確定最佳用酶，以期為提高地龍抗腫瘤活性、開發抗腫瘤新藥提供新思路。

1　儀器與試劑

1.1　儀器

UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；遠紅外輻射干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)；PHS-25型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；半微量凱式定氮儀；ST 16R高速冷凍離心機(默飛世爾科技(中國)有限公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；FA1004N萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；Memmert CO2培養箱(北京五洲東方科技發展有限公司)，EL340i型全自動酶標儀(Molecular Davices)。

1.2　試劑

胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶(國藥集團化學試劑有限公司)；甘氨酸(國藥集團化學試劑有限公司)；RPMI-1640培養基、胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)；MTT(武漢市蓋云天生物技術有限公司)；茚三酮(上海源聚生物科技有限公司)；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀(國藥集團上海化學試劑有限公司)。

1.3　供試品

地龍凍干粉(自制)。批號：20170701。

1.4　實驗細胞

肺腺癌細胞A549細胞株由山東省立醫院提供。

2　實驗方法

2.1　地龍粉的最佳用酶篩選

精密稱取地龍粉6份，每份1.0000 g，分別置于150 mL具塞錐形瓶中，按配料比1∶30定量加入蒸餾水，超聲提取30min，按表1條件進行實驗，得6種地龍粉酶解粗液，然后分別在3000 r/min條件下,離心10min，抽濾，定容至100 mL，得地龍酶解液。將每種地龍粉酶解液分成兩份，一份用于測定蛋白質水解度，另一份經凍干后用于藥理實驗。

表1　地龍粉酶解條件

2.2　酶解液中氨基肽氮含量的測定

2.2.1茚三酮顯色劑的配制

精密稱取茚三酮0.5 g，果糖0.3 g，磷酸氫二鈉10 g，磷酸二氫鉀6 g，用蒸餾水定容至100 mL。

2.2.2標準曲線的繪制

取0.1000 g干燥過的甘氨酸，加蒸餾水溶解后定容至100 mL，移取2 mL定容至100 mL，得 20μg/mL的溶液。分別取該溶液1、2、3、4、5 mL并定容到10 mL，得濃度為2、4、6、8、10μg/mL的標準溶液，分別取3 mL稀釋液于試管中，加入 1.00 mL顯色劑，混勻后沸水浴加熱15min，冷水冷卻，加入5 mL 40%乙醇溶液混勻，放置15min，在570 nm處測定吸光度A。以吸光度為橫坐標，以甘氨酸標準溶液-NH2質量為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2.36種樣品中含量測定

取6 種地龍粉酶解液適量定量稀釋到適宜的濃度，按“2.2.2”方法測定樣品的吸光度A，利用標準曲線計算-NH2的含量，再乘以稀釋倍數得水解液中總-NH2肽氮的含量。

2.3　半微量凱氏定氮法測定地龍凍干粉總氮量[5]

取地龍粉水提液8 mL，經消化、蒸餾、滴定過程，測定原料中總氮量。

2.4　水解度的計算

用2.2下茚三酮法計算出水解液中游離氨基肽氮含量，用2.3下半微量凱氏定氮法計算原料中總氮量，按以下公式計算水解度：

水解度(DH)%=已水解的肽鍵數/原料中總肽鍵數×100%=[(B-C)/(A-C)]×100%

式中：A：原料中的總氮數 B：水解液中的氨基氮數 C：原料中游離的氨基氮數

2.5　MTT法測定水解物對肺腺癌細胞(A549)的抑制率

2.5.1地龍提取物溶液的配制

精密稱取10 mg地龍酶解液凍干粉，溶于10 mL 1640培養液中，配成含有效成分2 mg/mL的濃度，在無菌環境下用0.22 μm的濾膜過濾，然后用已濾菌的1640培養基依次稀釋，配成0.125、0.25、 0.5、1、2 mg/mL的藥物濃度梯度。

2.5.2細胞培養[6]

2.5.2.1細胞復蘇

從超低溫冰箱中取出凍存的肺腺癌細胞，迅速投入預先加熱到37℃的滅菌水中，待凍存液融化后，以2000 r/min的轉速離心三分鐘，收集細胞，然后以含10%胎牛血清的1640新鮮培養基在37℃、5%CO2培養箱中培養。約24 h后更換培養基。

2.5.2.2接種

待細胞生長至80%融合時，以0.25%的胰酶細胞消化液(含0.02%EDTA)進行消化，以每孔100μL接種于96孔板中，預留三個調零孔，調零孔只加不含血清的1640培養基，不加細胞。

2.5.2.3加藥

待96孔板中的細胞長滿單層后，棄掉培養基，調零組、空白對照組加100μL不含血清的1640培養基，其他給藥組每孔分別加入含不同濃度地龍提取物的1640培養基100μL，每個濃度的藥物重復5個孔，其中以地龍粉水提液為對照組。然后細胞在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h。

2.5.3測定細胞抑制率

在每孔中加入5 mg/mL的 MTT溶液20 μL，于培養箱內避光反應4 h 。吸去上清液，然后加入 100 μL DMSO，用酶標儀于492 nm測定 OD值，按下式計算藥物對細胞的抑制率。

細胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調零組)/(空白組OD-調零組)]×100%

3　結果與分析

3.1　氨基肽氮含量的測定結果

3.1.1標準曲線的繪制

以吸光度為橫坐標，以甘氨酸標準溶液-NH2質量為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為:Y=0.7105x-0.0027，相關系數r2=0.9990。

3.1.2酶種類對樣品中氨基肽氮含量影響

樣品中氨基肽氮含量的測定結果如表2所示。

表2　水解液中氨基肽氮含量

從表2可看出：彈性蛋白酶作用下的地龍粉酶解液中-NH2的含量最高，其次是胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對應的水解液，木瓜蛋白酶水提液中-NH2最少。

3.2　酶種類對水解度的影響

利用半微量凱氏定氮法測得1.0000 g地龍粉中含氮量為48.7548 mg。根據2.4下水解度的計算公式可求出五種蛋白酶的水解度如圖1所示。

從圖中可看出彈性蛋白酶的水解度最大，為30.61%，其次是胰蛋白酶，胃蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，最后是木瓜蛋白酶，分別為：17.96%、9.42%、7.95%、3.04%。

圖1五種蛋白酶的水解度

Fig.1Hydrolysis degree of five kinds of proteases

3.3　MTT法測定樣品對肺腺癌細胞A549抑制率的影響

不同濃度梯度下6種地龍粉酶解液對肺腺癌細胞A549的抑制率如圖2所示，由圖2可知，藥物濃度大于0.5 mg/mL時，彈性蛋白酶、胰蛋白酶水解液對肺腺癌細胞A549的抑制效果明顯，胃蛋白酶水解液在藥物濃度超過0.5 mg/mL時無抑制效果，而胰凝乳蛋白酶對地龍的水解液只在0.25 mg/mL時有抑制效果，木瓜蛋白酶水解液、地龍粉水提液無抑制效果。

圖26種地龍水解液對肺腺癌細胞A549的抑制曲線

Fig.2Inhibition curves of 6 kinds of Hydrolysate of dragon's Dragon on lung adenocarcinoma A549

4　討論

肺癌是嚴重影響人類生存的惡性腫瘤之一，其死亡率已居全球惡性腫瘤之首。對于肺癌的治療，目前主要采取以化療為主的綜合治療方案，其療效并不理想，其主要原因是肺癌細胞可對化療藥物產生多藥耐藥性[7]。因此，尋找治療肺腺癌的新型藥物勢在必行。

已有研究表明，生物活性肽具有抗癌功效且對機體正常組織細胞無毒副作用。酶解法水解蛋白質是目前制備生物活性多肽的最常用的方法，它能改善蛋白質的功能和理化性質，同時不降低其營養價值。本次實驗采取酶解工藝，以彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶對地龍粉進行酶解，將地龍粉中的蛋白質分解為小分子多肽及寡肽等更具有藥理活性的物質。

彈性蛋白酶具有廣泛的水解活性，對明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質具有降解作用,是一種廣譜的肽鏈內切酶[8]；胰蛋白酶作為一種水解酶，專一作用于有堿性氨基酸精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵，酶本身很容易自溶，由原先的β-胰蛋白酶轉化為α-胰蛋白酶，再進一步降解為擬胰蛋白酶，乃至碎片，活力也逐步下降而喪失[9]；胰凝乳蛋白酶活性基團含有絲氨酸殘基，可在芳香族氨基酸的羧基處切斷肽鍵；胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵；木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶，可水解蛋白質和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，并優先水解在肽鍵的N-端具有兩個羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵。本研究采用酶解工藝，用彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶分別對地龍粉進行酶解，理論上可將地龍粉中的蛋白質分解為小分子多肽及寡肽等更具有藥理活性的物質。

本研究中各種酶對地龍粉的水解度大小為：彈性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶>胰凝乳蛋白酶>木瓜蛋白酶；其中胰蛋白酶酶解液在藥理活性中最顯著。由實驗結果可看出水解度與藥理活性并不是呈絕對的相關性。地龍粉由胰蛋白酶通過酶解工藝得到的酶解液中含有大量抑制肺腺癌細胞A549的小分子肽及活性物質，而通過木瓜蛋白酶得到的酶解液水解度低

且無抑癌效果，說明地龍粉通過木瓜蛋白酶酶解得到的小分子多肽等無抑癌作用。此外胃蛋白酶酶解液無明顯的抑癌效果的原因可能是強酸環境破壞了某些具有生物活性的物質。由本研究可看出地龍中含有較多抗肺腺癌的活性物質，且胰蛋白酶酶解產物在抗肺癌方面的效果顯著。

由實驗結果可知，彈性蛋白酶可以較大程度的將地龍粉水解成小分子多肽，胰蛋白酶在抑制肺腺癌細胞方面效果最佳，而胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶對于地龍粉抗癌活性的提高無應用價值。

[1]杜航,孫佳明,郭曉慶,等.地龍的化學成分及藥理作用[J].吉林中醫藥,2014(34):707-708.

[2]王愛華,柳美玲,戴志明,等.小肽的吸收機制與營養價值研究進展[J].上海畜牧獸醫通訊,2008(2):7.

[3]王克夷.開發小肽,篩選新藥[J].中國生化藥物雜志,2003,24(1):48.

[4]何歡，李文平.地龍的主要成分及其作用的研究[J].畜牧獸醫雜志,2008,27(3):28.

[5]國家藥典委員會.中國藥典2010年版.一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010：附錄53-54.

[6]焦方文，王集會，鄒龑，等.全蝎粉酶解工藝最佳用酶的初步篩選[J].時珍國醫國藥，2015，26(10)：2407-2408.

[7]劉小菊,劉紅云,王海娟,等.肺腺癌A549/DDP細胞多藥耐藥機制及中藥逆轉劑的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2015(21)：227-230.

[8]劉小杰，陳啟和，孫橋.彈性蛋白酶的研究進展[J].中國食品添加劑，2004(4)：29-32.

[9]劉春雨，張盼盼，王穎,等.蜈蚣粉酶解工藝最佳用酶的初步篩選[J].中南藥學，2017(6)：759-762.