黃瓜CsWRKY32基因的cDNA克隆及生物信息學分析

張 穎, 劉 佳, 廉 想, 張金梅, 佟德利

(沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034)

黃瓜起源于印度,是世界栽培廣泛的園藝作物之一,在我國設施內栽培面積大,因其風味和口感廣受人民喜愛,在蔬菜生產和消費中占重要地位,但我國設施環境中的亞適宜問題對黃瓜的產量和品質產生重要影響。自2009年黃瓜全基因組測序以來[1],釋放了大量的基因組數據,隨后進行了轉錄組的測序,為黃瓜的品質改良提供了豐富的組學數據,為進一步從基因水平提高黃瓜的品質提供契機。

WRKY是近年來廣泛研究的熱點轉錄因子,自從1994年從甘薯中被發現以來,研究人員利用遺傳學、分子生物學和生物信息學等方法,逐步揭示了WRKY轉錄因子的功能,發現它們不僅參與植物生長發育、生物及非生物脅迫的過程,還參與一些特殊的代謝途徑。但WRKY轉錄因子調控植物響應逆境,以及詳細的生理生化反應分子機制,目前尚未完全解析清楚[2]。借助黃瓜基因組、轉錄組測序完成的契機,以黃瓜為研究對象,利用生物信息學工具在轉錄調控水平研究WRKY轉錄因子這個調控基因表達的開關,以期揭示黃瓜在設施內亞適宜環境下的調控機制,為設施黃瓜調控抗逆提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種為設施溫室內抗病抗逆品種“中農26”,種子購買于中國農業科學院蔬菜花卉研究所。

植物總RNA的提取采用TRIzol方法進行, 提取后測定其濃度,取5 μg RNA進行cDNA反轉錄。使用Fermentas公司的Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒進行cDNA合成。RT-PCR所用的酶及T載體均購自Vazyme公司。

1.2 方 法

1.2.1 黃瓜總RNA的提取及cDNA克隆

本實驗于沈陽師范大學生化與分子生物學實驗室進行,2017年2月將黃瓜種子經消毒后催芽,種子露白播種于50孔穴盤,育苗基質為按體積比為2∶1混配的草炭和蛭石。出苗后待第一片真葉完全展開,分苗到營養缽里(直徑10 cm)。之后培養于沈陽師范大學日光溫室內。當黃瓜生長至兩葉一心時,提取葉片組織RNA,反轉錄后進行RT-PCR,電泳回收后轉入GV pXT19-T Vector的載體中,進行TA克隆,篩選獲得陽性克隆后,送上海生工公司測序并做序列比對。

1.2.2CsWRKY32基因的生物信息學分析

應用生物信息學軟件分析CsWRKY32基因及其推導的氨基酸序列的性質,應用GSDS[3]軟件繪制CsWRKY32基因的結構;應用SMART軟件預測WRKY結構域,利用NetPhos 2.0 Server進行磷酸化位點預測,PORTII軟件預測基因的亞細胞定位。使用MEGA軟件構建系統發育樹,系統進化樹選用鄰位相接法(neighbor-joining),設置bootstrap檢驗的重復次數為1 000次。

2 結果與分析

2.1 CsWRKY32的cDNA克隆

CsWRKY32基因克隆以兩葉一心的黃瓜葉片做實驗材料,液氮速凍后提取RNA,如圖1a所示,得到較為清晰的28S,18S和5.8S三條RNA條帶,證明RNA提取完整,經ScanDrop200測試RNA濃度,得A260/280在2.0～2.2之間,證明RNA純度較高。進一步應用表1引物進行RT-PCR克隆CsWRKY32,如圖1b所示,除目的條帶1 000 bp左右,還出現一條非特異性擴增條帶,因此,我們割膠回收目的條帶進行TA克隆,經藍白斑篩選后,選擇白斑,提取質粒進行酶切檢測,如圖1c所示,為BglⅡ及SpeⅠ酶切質粒的電泳圖。出現目的條帶送菌液測序。

表1 PCR引物表Tab.1 Primers used for PCR assays

(a)—黃瓜RNA提取電泳圖; (b)—CsWRKY32逆轉錄PCR電泳圖; (c)—TA克隆后雙酶切電泳圖圖1 CsWRKY32的基因cDNA克隆電泳圖Fig.1 cDNA clone of CsWRKY32 gene

2.2 CsWRKY32基因的生物信息學分析

2.2.1CsWRKY32的基因結構及序列分析

CsWRKY32的cDNA開放閱讀框全長975 bp,如圖2a顯示,由5個外顯子和4個內含子組成,外顯子1、2、3、4、5大小分別為1～84、196～264、730～1068、1948～2064、2544～2909 bp;該基因編碼的蛋白預測由324個氨基酸組成, WRKY結構域進行預測結果表明:CsWRKY32蛋白含有一個WRKY結構域,位于蛋白的166個氨基酸到226個氨基酸之間(圖2b)。依據Eulgem[4]等 的分類方法,屬于Ⅱ類WRKY轉錄因子。PORTII軟件進行亞細胞定位預測后,結果表明該蛋白60.9%定位于細胞核中,17.4%定位于細胞質,13.0%定位于細胞支架,4.3%定位于高爾基體,4.3%定位于線粒體。這一結果符合CsWRKY32是轉錄因子的特性。

圖2 預測CsWRKY32的基因結構及蛋白質結構域Fig.2 Analysis of CsWRKY23 gene structure and prediction of WRKY domain

2.2.2CsWRKY32預測蛋白基本性質分析

應用 http:∥web.expasy.org/protparam/網站對CsWRKY32蛋白進行理化性質分析:CsWRKY32蛋白的等電點為6.35、分子量為36.3 kDa;其中帶有負電荷的氨基酸(Asp+Glu)46個,帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)44個,平均親水系數(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.766,脂肪系數(aliphatic index)為71.02,通常認為平均親水系數越低,蛋白親水性越強[5],因此,預測CsWRKY32是一個親水蛋白。應用ProtScale網站對CsWRKY23蛋白做親疏水性分析,氨基酸標度選Hphob.Kyte & Doolittle為默認值,如圖3所示,該蛋白的324個氨基酸的親疏水性分析結果表明,氨基酸標度的最大值是第308位氨基酸的2.289,氨基酸標度最小值是119位氨基酸的-2.911。應用Expasy網站的Swiss-Model工具進行蛋白質的三維結構的預測,并用Swiss PDB viewer軟件顯示,預測的三維結構有5個β折疊片(圖4)。

圖3 CsWRKY32的親水性、疏水性分析Fig.3 Hydrophobic or hydrophilic property of CsWRKY32

圖4 CsWRKY32的三維結構預測Fig.4 Prediction of 3-D structure of CsWRKY32

利用NetPhos 2.0 Server 軟件[6-7]對CsWRKY32的蛋白序列進行潛在的磷酸化位點預測,結果表明, 該蛋白含有潛在的絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr和酪氨酸Tyr磷酸化位點,其中磷酸化位點數目最多是Ser,為20個,其次為Tyr,有6個,最少的為Thr,有4個。

2.2.3 CsWRKY32系統發育分析

利用NCBI的BLAST功能在UniProKB數據庫中與CsWRKY32序列比對,獲得得分較高的WRKY蛋白10個,如圖5所示,分別是AtWRKY18(Q9C5T4.2)、AtWRKY60(Q9SK33.1)、AtWRKY40(Q9SAH7.1)、OsWRKY76(Q6IEK5.1)、OsWKRY62(Q6EPZ0.1)、AtWRKY47(Q9ZSI7.2)、AtWRKY42(Q9XEC3.1)、AtWRKY9(Q9C9F0.1)、AtWRKY72(Q9LXG8.1)和AtWRKY36(Q9CAR4.1),系統發育樹如圖5所示,結果表明AtWRKY40與CsWRKY32是同源基因,這與我們之前的研究結果[8]吻合。

圖5 CsWRKY32的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic analysis of CsWRKY32

3 討 論

WRKY轉錄因子是高等植物中最大的轉錄因子家族之一,具有特殊的WRKYGQK保守的結構域[9]。在植物的一生中生物脅迫與非生物脅迫時有發生,諸多的研究表明WRKY轉錄因子參與了干旱[10-11]、高鹽[12]、低溫[13-14]等非生物脅迫,并在植物的抗逆過程中起到了重要的調控作用,這為改良設施環境內園藝作物的產量和品質提供了新思路。

隨著黃瓜基因組、轉錄組測序的完成, 以及生物信息學的發展[15], 以黃瓜為研究對象揭示WRKY轉錄因子的功能的報道逐漸增多, 李勝男等[16]揭示了黃瓜WRKY30在霜霉威脅迫下的表達變化及功能, 張穎等[17]揭示了黃瓜CsWRKY23這個含有2個WRKY結構域的基因響應低溫脅迫, 并且對其蛋白的功能進行了生物信息學預測。 但目前對單一WRKY轉錄因子的功能研究較多, 對于其調控的網絡通路、上下游作用因子尚不明確[18-19]。 因此, 要進一步借助組學及生物信息學的工具對WRKY轉錄因子的調控網絡進一步預測, 進而利用分子生物學、遺傳學以及生物化學等手段驗證其網絡節點的作用。

4 結 語

本研究表明,黃瓜CsWRKY32基因開放讀碼框全長975 bp,含有一個WRKY結構域,屬于類ⅡWRKY轉錄因子,與擬南芥AtWRKY40同源。車永梅等[10]研究表明,AtWRKY40響應干旱信號,參與干旱脅迫反應;這與我們前期在黃瓜上的研究結果不盡相同,Ling等[8]在黃瓜幼苗期利用半定量RT-PCR研究CsWRKY32發現,其并未響應干旱等非生物脅迫,但該基因在黃瓜結果期是否響應干旱脅迫的研究尚未見報道。此外,AtWRKY40參與植物對抗脅迫的過程,并在調控脅迫響應的編碼葉綠體及線粒體蛋白的核基因中起了重要作用[20]。這些為繼續研究黃瓜CsWRKY32基因的功能提供了思路。