兩種方法從林麝糞便提取DNA效率及分析

唐　婕,李晶晶,王　波,索麗娟,李斐然,劉文華,王　艷,嚴興榮

(1.陜西省動物研究所，西安　710032; 2.西北大學 生命科學學院，西部資源與生物技術教育部重點實驗室，西安　710069；3.秦嶺珍稀瀕危動物保育重點實驗室，西安　710069)

野生動物是維持全球生物多樣性的重要組成部分，對野生動物的保護也成為中國一項基本國策。目前，根據野生動物現有數量制訂不同保護級別，如秦嶺6寶(大熊貓、金絲猴、羚牛、朱鹮、林麝和金錢豹)均列為國家一級保護動物，其中雄性林麝分泌的麝香具有重要的藥用價值， 在醫藥行業有“軟黃金”之稱。早期麝香主要來自野外捕殺的雄麝，雌性林麝除沒有外露的獠牙以外，外觀與雄麝沒有區別，捕殺雄麝的同時，雌麝也遭殃，這導致林麝數量逐年減少[1]。為了保護其寶貴的種質資源，人工圈養的方法逐漸被推廣，目前陜西省鳳縣人工圈養林麝超7 000只[2]。隨著養殖技術的不斷改進，人工圈養林麝數量也呈明顯上升趨勢。圈養林麝數量雖然不斷增加，但其遺傳多樣性卻不斷降低，目前尚無有效的遺傳多樣性監控手段。DNA提取是進行遺傳學檢測的基礎，如何保證在無損傷條件下大量采集林麝DNA，是林麝養殖技術的關鍵環節。林麝天性膽小，任何人為干擾都會造成應激，可能會影響林麝生產性能[3]。自然掉落的毛發和糞便是提取DNA常用樣本，但林麝自然掉落的毛發沒有毛囊，影響DNA獲得效率。如要獲得帶有毛囊的毛發，這就需要對林麝進行抓捕拔毛，但這會對其造成不必要的應激反應[4-5]。糞便是林麝的排泄物，可在不干擾林麝自身活動的條件下獲得樣本。野生林麝糞便采集同樣是種質資源監控和保護的一部分，野生林麝糞便采集困難，新鮮糞便的采集就更難。糞便排泄后多長時間能有效提取DNA，這是本研究工作之一。傳統糞便DNA提取采用商品化的專用提取試劑盒進行[6]。這種方法獲取DNA的成本高，不利于大量樣品分析。本研究改進原有方法，結合普通細胞DNA提取試劑盒進行提取，比較和探索兩種方法提取林麝糞便DNA以及糞便排泄后不同時間DNA提取效率，為后續林麝遺傳監控中DNA提取奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　動 物

林麝在陜西省寶雞市鳳縣周家莊村蔣家溝陜西省動物研究所林麝野外科學研究基地進行飼養。海拔1 300～1 500 m，一天飼喂兩次，自由飲水采食(主要以天然樹葉為主，瓜果及胡蘿卜為輔)。

1.2　糞便采集

清晨5點在圈舍內收集新鮮糞便樣本，用天平稱取0.5 g置于5 mL EP管，分為4組，在室溫下放置0、2、4、6 d，備用。提取DNA前對糞便外觀和形態進行觀察和拍照。野生林麝糞便采自太白縣黃柏源處。

1.3　DNA提取

對照組DNA提取：糞便DNA用FastDNA SPIN Kit for Feces (11657022, MP, USA)進行提取，按照說明書進行操作，具體參照以前的研究報道[7]。

試驗組DNA提取：相同數量的糞便添加3 mL 磷酸緩沖液靜置1 min，劇烈震蕩30 s， 充分吸出液體部分，2 000 r/min離心10 min，接下來用普通細胞DNA提取試劑盒[Biospin Cell Genomic DNA Extraction Kit (BSC05S1, Bioflux, Shanghai)]進行提取，最后將提取的DNA溶液置-20 ℃冰箱，備用。

1.4　PCR擴增

對照組和試驗組提取的DNA用PCR擴增試劑盒進行擴增，具體操作參照以前的研究報道[8]。以林麝甘油醛-3-磷酸基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為模版，用primer 5.0設計引物，在北京奧科生物技術有限公司進行合成。引物序列如下：forward: 3′-TCACCGAGGCTGCTTTTAAT-5′, reverse: 3′-GATCTCGC TCCTGAGAGATG-5′。擴增用20 μL體系，其中DNA模版0.3 μL，上下引物各0.6 μL，添加無菌ddH2O至10 μL， 添加2×PCR mix 10 μL，混勻，4 000 r/min離心30 s。用博日PCR擴增儀(TC-XP，Hangzhou，China)進行擴增，擴增條件：94 ℃ 5 min，進入循環95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增的DNA用瓊脂糖凝膠電泳分離，結果用凝膠成像系統(Champhemi Top 610, Saizhi,Beijing,China)進行觀察并用分析軟件(Lane 1D Analysis Software, Saizhi, Beijing, China)對DNA條帶進行分析，測量DNA條帶的光密度值(DNA條帶光密度與DNA量呈正相關)，以0 d的光密度值為參考，其他時間點的光密度值與之相比，獲得相對光密度值。

1.5　統計學方法

所有試驗獨立重復3次，數據用“平均數±標準差”表示，用Spass 13.0軟件進行統計分析，通過t檢驗進行顯著性統計分析。

2　結果與分析

2.1　空氣暴露影響林麝糞便的形態變化

如圖1所示，健康新鮮林麝糞便表面為光滑的不規則圓形或橢圓形，水分飽滿，光澤性強(圖1-A)；2 d后表面變得粗糙無光澤，部分區域出現塌陷(圖1-B)。4 d后糞便表面塌陷部位增多，表面形態沒有變化(圖1-C)；6 d后表面比較粗糙，表面塌陷部分比4 d多(圖1-D)。由于在空氣中直接暴露，糞便表面水分開始丟失，表面由于水分減少，外觀沒有光澤，糞便表面沒有水分的支撐開始凸凹不平，外觀粗糙。隨著時間延長，外部水分丟失的同時，內部水分開始丟失，糞便開始皺縮，體積變小。

新鮮糞便 (A) 和分別在空氣暴露2 d (B)、4 d (C)和6 d (D)的糞便
Fresh feces (A) and feces was exposed in air for 2 d (B), 4 d(C) and 6 d (D) (bar =1 cm)

圖1糞便在空氣中暴露不同時間
Fig.1Differentexposuretimeofmuskdeerfecesinair

2.2　對照和試驗組均可提取糞便DNA

對照組和試驗組的方法均可有效提取林麝DNA(圖2-A,2-B)，但試驗組提取DNA的量顯著高于對照組 (P<0.05)。與對照組相比，試驗組的方法可顯著提高DNA提取效率，每個樣本能節省1 h左右時間。對照組用的是常規糞便總DNA提取試劑盒，需要對糞便研磨和反復離心的復雜操作，富集糞便總DNA，所用時間較長，同時復雜的操作可能會造成總DNA丟失。試驗組的方法，用PBS沖洗糞便表面的林麝細胞和微生物，減少糞便的研磨和復雜的程序，用細胞DNA提取試劑盒直接提取，所用時間明顯減少。

2.3　糞便放置時間延長可降低兩種方法提取DNA的效率

兩種方法均可有效提取不同空氣暴露時間的糞便DNA，DNA量均隨時間延長逐漸減少，但差異不顯著(P>0.05)(圖2-B,3-B)。空氣暴露2 d和4 d，試驗組獲得的DNA量顯著上升(P<0.05)，6 d回到正常水平(圖2-B)；對照組僅在2 d 提取的DNA量上升 (P<0.05)，而4 d 和6 d顯著下降到正常水平(圖3-B)。每個時間點試驗組獲得的DNA顯著高于對照組(P<0.05)。糞便成分復雜，除腸道上皮細胞外，還有復雜的微生物。糞便在體外直接空氣暴露，糞便微生物進一步擴增，同時也可能對糞便內腸道細胞進行破壞和分解，導致細胞數量下降，因此兩種方法提取DNA的量在第6天均呈下降趨勢。由于糞便表面水分丟失快于糞便內，糞便內的微生物擴增可能較表面快。微生物對腸道上皮細胞的破壞速率與微生物的擴增呈正相關，本研究提取DNA的效率也證明這一點。

2.4　兩種方法可用于野外林麝糞便DNA提取

如圖3所示，本研究用野外采集的1份林麝糞便樣本，從外觀判斷排糞時間超過7 d，用兩種方法提取DNA，均可有效獲取DNA，但試驗組提取糞便DNA的量顯著高于對照組(P<0.05)。野外林麝糞便由于采集時間不確定，外形容易與其他種類動物如黃羊、斑羚的糞便相混。因此需要進行PCR進行確定。野外糞便空氣暴露的時間較長，需要用可靠的方法進行DNA提取，由于試驗組的方法僅用糞便表面的腸道上皮細胞，進一步說明試驗組方法在野外成顆粒狀糞便DNA提取的可靠性。

對照組 (A) 和試驗組 (B) 提取糞便DNA的PCR產物條帶；糞便不同空氣暴露時間對照組 (C) 和試驗組 (D)兩種方法提取DNA的相對量；每個時間點對照組和試驗組DNA相對含量比較 (D)
Bands of PCR production of DNA were presented by control (A) and treated (B) methods. Relative quantity of DNA was showed by control (C) and treated (D) methods for different time of air exposure. Relative quantity of DNA was presented between control and treated methods at each time point (E)

圖2兩種方法提取籠養林麝糞便DNA的效率
Fig.2EfficiencyofDNAextractionofcagedforestmuskdeerfecesbytwomethods

3　討 論

種質資源調查和遺傳多樣性檢測離不開動物DNA樣本的采集，在不影響動物活動的前提下采集DNA樣本是最佳選擇[9]。尿液和糞便是動物排泄物，可在不近距離接觸動物的前提下采集。尿液理論上是最佳的樣本選擇，尿液中動物尿道細胞比較純，有研究用尿液培養出細胞[10]。因此，尿液也可提取DNA并且可避免大量細菌微生物的干擾。牛羊等動物尿液排泄較多且地點固定，可大量收集。林麝等野生動物常在野外，并且排尿少，即使在圈舍，排尿和排糞常在同一位點，很難獲得質量好的尿液，所以尿液的采集對于野生動物很難適用。糞便是固體，在野外和養殖場所均容易采集，但糞便DNA的提取容易受到糞便細菌DNA的影響。如何減少糞便細菌DNA的影響提高動物DNA純度，是目前亟待解決的問題。糞便DNA提取用于野生動物微衛星檢測、遺傳標記和物種野外調查等研究，因此糞便是野生動物DNA采集所需的重要樣本。糞便DNA提取主要用糞便提取試劑盒，也有研究對糞便樣本DNA提取程序進行優化，但這些方法提取的是糞便總DNA[6,11]。本研究同樣用糞便DNA提取試劑盒也能有效提取林麝糞便DNA，但耗時耗力。林麝糞便在直腸顆粒化后在腸道中移行，因此糞便表面攜帶的腸道上皮細胞比其內部多。通過試驗組方法，直接收集糞便表面的細胞來提取DNA，也可達到相同的效果。糞便在空氣中暴露可影響林麝DNA樣本的提取。糞便在空氣中長時間暴露，可導致糞便脫水。季節不同，糞便在空氣中暴露時間不同，形態也有差異。這方面研究報道較少，本研究發現林麝糞便空氣中長期暴露，影響林麝DNA的提取，這可能是糞便空氣暴露時間延長，導致腸道微生物破壞糞便內外的腸上皮細胞所造成的。

兩種方法(對照組和試驗組)提取DNA的PCR產物條帶 (A)，兩種方法提取DNA的PCR產物相對量 (B)
Bands of PCR production of DNA extraction were presented (A), relative quantity of PCR production with two methods was shown (B)

圖3野生林麝糞便的DNA提取
Fig.3ExtractionofDNAfromfecesofwildforestmuskdeer

本研究用試驗組的方法可顯著減輕糞便DNA提取的工作量，糞便在空氣暴露時間過長可影響DNA提取效率，空氣暴露4 d內均可有效提取糞便DNA，這些研究為后續大樣本糞便DNA的提取提供參考。

參考文獻Reference：

[1]馬綱,張敏,王文文.我國瀕危野生動物的瀕危因素分析[J].天水師范學院學報,2011,31:38-42.

MA G,ZHANG M,WANG W W.Analysis on the endangerment factors of endangered wild animal in China[J].JournalofTianshuiNormalUniversity,2011,31:38-42.

[2]裴俊峰,吳家炎.陜西秦嶺西部林麝養殖現狀及存在問題[J].四川動物,2007,26(4):952-954.

PEI J F,WU J Y.Present situation of must deer farming in Western Qinling Mountains of Shaanxi[J].SichuanJournalofZoology,2007,26(4):952-954.

[3]蘇麗娜,吳曉民,張洪峰.鳳縣林麝棲息地干擾狀況分析[J].陜西林業科技,2010,33(5):25-29.

SU L N,WU X M,ZHANG H F.Disturbance analysis of forest musk deer(Moschusberezovskii) habitat in Fengxian County[J].ShaanxiForestScienceandTechnology,2010,33(5):25-29.

[4]王永奇,白康,任戰軍,等.林麝AR基因外顯子1、4、8的克隆和多態性檢測[J].家畜生態學報,2015,36(6):11-14.

WANG Y Q,BAI K,REN ZH J,etal.Colone and polymorphism analysis of exon1,exon4 and exon8 in androgen receptor gene ofMuschusberezorskii[J].JournalofDomesticAnimalEcology,2015,36(6):11-14.

[5]夏珊,岳碧松.林麝MHC-DRA基因分析及與反芻亞目DRA基因比較[J].四川動物,2014,33(4):481-486.

XIA SH,YUE B S.Analysis of forest musk deer(Moschusberezovskii)MHC-DRAgene exon 2 and compared with other Ruminantia[J].SichuanJournalofZoology,2014,33(4):481-486.

[6]王立志,徐誼英,蔡永華.高通量測序分析人工養殖成年林麝糞便古菌菌群多樣性[J].動物營養學報,2016,28(2):477-484.

WANG L ZH,XU Y Y,CAI Y H.Fecal archaeal diversity of artificial breeding adult forest musk deer analyzed by high-throughput sequencing technologies[J].ChanisesJournalofAnimalNutrition,2016,28(2):477-484.

[7]ARIEFDJOHAN M W,SAVAIANO D A,Nakatsu C H.Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens[J].NutritionJournal,2010,9:23.

[8]KIM K Y,LE Q T,PINSKY B A,etal.Summary of current state of PCR-Based Epstein-Barr Virus DNA testing for nasopharyngeal cancer[J].JournaloftheNationalCancerInstitute,2017,109(4).

[9]DING B,ZHANG Y P,RYDER O A.Extraction,PCR amplification,and sequencing of mitochondrial DNA from scent mark and feces in the giant panda[J].ZooBiology,1998,17:499-504.

[10]ZHANG D Y,WEI G H,LI P,etal.Urine-derived stem cells:a novel and versatile progenitor source for cell-based therapy and regenerative medicine[J].Genes&Diseases,2014,1:8-17.

[11]劉剛,徐超群,何嵐,等.圈養林麝線粒體D-100 p區序列多態性的糞便DNA分析[C].全國生物遺傳多樣性高峰論壇會刊,2012:19-20.

LIU G,XU CH Q,HE L,etal.Fecal DNA analysis of mitochondrial d-100 p sequence polymorphism in captive forest musk deer[C].National Biogenetic Diversity Peak BBS Journal,2012:19-20.