滲透脅迫下紫花苜蓿生長及ABA受體基因的表達

薛澤民，薛　琪，高景慧

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌　712100)

水分控制植物生長發育及其形態形成，影響植物地上與地下的協同生長及其生理反應，參與作物生物量的積累[1]。作為草食家畜主要的蛋白飼料，紫花苜蓿(Medicagosativa)產量的提升是當前中國苜蓿育種的熱點[2]。佟長福等[3]研究苜蓿葉水勢、蒸騰速率在不同灌溉水平下的日變化規律及其與土壤含水率和氣象因素之間的關系，建立葉水勢和蒸騰速率與氣象因素間的定量關系式。劉玉華等[4]研究旱作條件下紫花苜蓿光合蒸騰日變化與環境因子之間的關系，認為對光合蒸騰特性起主要決定作用的因子是光和有效輻射，主要限制因子是大氣溫度。

在干旱條件下，胞間CO2濃度發生變化，使細胞氣孔大小改變，降低蒸騰作用的水分散失，造成光合作用變化而影響地上和地下部分生長，在中、重度干旱時，會造成作物急速減產甚至死亡[5-6]。氣孔影響苜蓿蒸騰作用，對其抗旱能力有顯著的調節作用[7]。脫落酸ABA(Abscisic acid)調節植物氣孔的關閉，參與植物逆境相關的各種生理生化過程[8]。2009年擬南芥(Arabidopsis)ABA受體(Receptor)的發現和分子功能的驗證，為ABA信號通路的逆境研究提供理論基礎[9]。ABA受體復合體ABA/PYL/PP2C引起氣孔關閉，調控ABA信號通路，影響植物的抗旱能力[10]。pRD29A:PYL9具有極強的抗旱能力和快速感受水分脅迫的能力[11]。ABA受體PYL8和PYL9分別互作MYB77和MYB44，調控植物缺水時的向水性[12]，在水稻中過表達PYL5則能夠增強其抗旱能力[13]。目前，苜蓿ABA抗逆的研究多集中于生理方面，而有關ABA受體與滲透脅迫間關系的研究則鮮有報道[14]。

本試驗以不同品種紫花苜蓿為研究材料，對其滲透脅迫下生長及生理指標進行測定，研究滲透脅迫下苜蓿ABA受體基因的表達情況，以期為今后苜蓿ABA受體在干旱逆境中的應用及抗逆育種提供科學依據。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

紫花苜蓿品種：‘三得利’(Sanditi)、‘賽迪5’(Sardi 5)由百綠國際草業公司引進，‘新牧2’(Xinmu 2)由新疆農業大學草業工程學院育成，購自楊凌金道種子公司。‘WL656’‘WL168’‘WL903’‘WL712’‘WL343’為美國進口品種，購自北京正道公司。

1.2　試驗方法

1.2.1幼苗培養試驗于2016年11月在西北農林科技大學動物科技學院草業科學實驗室進行。挑選整齊一致完整的紫花苜蓿種子，用φ=5% NaClO進行種子消毒，浸泡30 min，期間每隔10 min攪拌1次，最后用蒸餾水沖洗3～4次，并用吸水紙吸干殘留水分。在121 ℃下對培養皿進行高壓滅菌，持續40 min。將消毒種子均勻地擺在墊有濾紙的培養皿中，每個培養皿50粒種子，于(25±1)℃、1 500 lx(12 h/d)的光培養箱中萌發。待2片子葉完全展開時選擇健康、生長一致的幼苗進行移栽，1/4 MS營養液培養。幼苗第3片真葉完全展開時對幼苗進行處理，每個處理設3個重復，處理時間分為3、5、7 d。處理為對照(CK)：1/2 MS營養液；脅迫(TM)：1/2 MS營養液+150 g/L PEG-6000。

1.2.2幼苗指標測定及方法幼苗處理3、5、7 d后測定以下指標。根長和苗長：用根系掃描儀掃描植株，再利用winRHNZOR分析軟件進行測定，每處理測定5株，取均值；相對含水量(RWC)：采用烘干法測定[15]，分別測定其鮮質量(FW)，飽和鮮質量(SFW)，干質量(DW)，其中，RWC=(FW-DW)/(SFW-DW)；鮮干比(FW/DW)；脯氨酸質量分數：采用酸性茚三酮法測定[16]。

1.2.3ABA受體基因的表達測定苜蓿幼苗總RNA提取采用Trizol法。cDNA采用Takara反轉錄試劑盒合成。反應條件：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。Real-time PCR內參基因為ACTINα，反應程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環。ABA受體基因的PCR反應程序與內參基因相似。所用引物由楊凌保新公司合成，引物序列見表1。

1.3　數據處理

試驗數據用Excel 2007整理，數據用“平均值±標準差”表示，采用PASW statistics18進行差異顯著性分析。

表1　基因和引物序列Table 1　Genes and sequences of primers

2　結果與分析

2.1　150 g/L PEG處理對紫花苜蓿幼苗生長的影響

2.1.1紫花苜蓿幼苗的地下生長由圖1可知，與CK相比，干旱脅迫下不同品種第5、7天的根長都呈下降趨勢。其中，下降最大是‘三得利’，分別下降16.09%和15.88%(P<0.05)；下降最小是‘WL168’，分別下降1.23%和10.58%(P<0.05)。不同品種CK幼苗根長第7天比第3、5天增加。其中，增加最大的是‘WL168’，分別增加15.12%和12.52%(P<0.05)；增加最小是‘三得利’，分別增加9.18%和1.33%(P<0.05)。不同品種TM幼苗根長變化差異不顯著。表明干旱脅迫可以顯著抑制苜蓿的地下生長。

2.1.2紫花苜蓿幼苗的地上生長由圖2可知，與CK相比，干旱脅迫下第5、7天不同品種苗長都呈下降趨勢。其中，下降最大是‘三得利’，分別下降23.22%和23.71%(P<0.05)；下降最小是‘WL168’，分別下降10.48%和18.06%(P<0.05)。不同品種CK苗長第7天比第3、5天增加。其中，增加最大是‘WL168’，分別增加20.18%和11.33%(P<0.05)；增加最小是‘三得利’，分別增加11.49%和4.30%(P<0.05)。不同品種TM苗長變化差異不顯著。表明干旱脅迫可以顯著抑制苜蓿幼苗地上部分的生長。

“*”表示差異顯著(P<0.05)，下圖同　“*”Significant difference in the same bar(P<0.05).The same below

圖2　150 g/L PEG處理下紫花苜蓿幼苗植株的生長Fig.2　Stem length of alfalfa under 150 g/L PEG stress

2.1.3紫花苜蓿鮮干質量比植物的鮮干質量比反映干物質積累程度。由圖3可知，干旱脅迫下第5、7天不同品種鮮干比顯著低于CK。其中，降低最大是‘三得利’，較對照分別下降36.41%和37.81%(P<0.05)；降低最小是‘WL168’，分別下降18.71%和24.51%(P<0.05)。不同品種TM幼苗鮮干比第7天比第3、5天下降，下降最多是‘WL168’，分別下降27.03%和10.60%(P<0.05)；下降最小的是‘三得利’，分別下降17.58%和5.45%(P<0.05)。不同品種CK幼苗鮮干比變化差異不顯著。表明干旱脅迫下，植物可能通過降低鮮干比來儲存營養物質，度過干旱時期。

2.1.4紫花苜蓿葉片相對含水量由圖4可知，與CK相比，干旱脅迫下第5、7天不同品種葉片相對含水量都呈下降趨勢。其中，下降最大是‘三得利’，分別下降15.01%和16.71%(P<0.05)；下降最小是‘WL168’，分別下降7.66% 和13.31%(P<0.05)。不同品種CK幼苗相對含水量變化差異不顯著。不同品種TM幼苗相對含水量第7天比第3、5天顯著降低，下降最多是‘WL168’，分別降低11.56%和6.95%(P<0.05)；下降最小是‘三得利’，分別降低8.47%和2.75%(P<0.05)。表明干旱脅迫下，苜蓿通過降低體內水分含量來降低蒸騰，對苜蓿抵抗干旱有重要作用。

圖3　150 g/L PEG處理下紫花苜蓿幼苗鮮干比Fig.3　Fresh-dry ratio of alfalfa under 150 g/L PEG stress

圖4　150 g/L PEG處理對紫花苜蓿幼苗相對含水量Fig.4　Relative water content of alfalfa under 150 g/L PEG stress

2.1.5紫花苜蓿幼苗脯氨酸質量分數由圖5可知，與CK相比，干旱脅迫下第5、7天不同品種脯氨酸質量分數都呈上升趨勢。其中，增加最大是‘WL168’，分別增加24.47% 和39.04%(P<0.05)；增加最小是‘三得利’，分別增加15.39%和21.24%(P<0.05)。不同品種CK幼苗間脯氨酸質量分數變化差異不顯著。不同品種TM幼苗第7天比第3、5天顯著增加，增加最大的是‘WL168’，分別增加27.45%和12.02%(P<0.05)。增加最小是‘三得利’，分別增加19.55%和9.60%(P<0.05)。表明干旱脅迫下，苜蓿能夠通過增加體內脯氨酸來調節體內代謝，應對外界脅迫。

圖5　150 g/L PEG處理下紫花苜蓿幼苗脯氨酸的質量分數Fig.5　Proline mass fraction of alfalfa under 150 g/L PEG stress

通過以上研究，發現抗干旱脅迫最強是‘WL168’，干旱脅迫對其根長、苗長、鮮干比和相對含水量的影響最小，其脯氨酸質量分數最高，抗旱性最強。抗旱性最弱是‘三得利’。各品種抗旱性強弱為：‘WL168’>‘新牧2’>‘WL712’>‘賽迪5’>‘WL343’>‘WL656’>‘WL903’>‘三得利’。

2.2　ABA受體基因表達

蒺藜苜蓿為豆科模式植物，含有ABA受體9種，如圖6所示，檢測PEG干旱脅迫處理下，抗旱苜蓿品種‘WL168’幼苗ABA受體基因( Medtr1g016480、 Medtr1g028380、 Medtr3g071740、 Medtr3g090980、 Medtr4g014460、 Medtr5g030500、 Medtr5g083270、 Medtr7g070050和 Medtr8g027805)在根莖葉中的相對表達量。根據試驗設計，本試驗中對照組目的基因的相對表達量為1。結果顯示：苜蓿品種‘WL168’的9個ABA受體基因在干旱條件下， Medtr1g016480和 Medtr5g083270的相對表達量顯著高于其他基因，二者在根莖葉中表達量分別為6.10、1.79、3.04和6.51、1.67、1.89，與CK相比分別提高510.3%、79.1%、204.3%和551.2%、67.4%、89.5%；其表達量強弱為：根>葉>莖。說明干旱脅迫下ABA受體基因調控苜蓿幼苗產生ABA主要作用在根和葉中，根首先感受到環境變化產生ABA信號，莖起到傳輸作用，ABA信號在葉中積累。表明在滲透脅迫下，苜蓿通過 Medtr1g016480和 Medtr5g083270表達量的提高來調節體內生理和生長變化，從而度過干旱逆境。

圖6　150 g/L PEG處理下紫花苜蓿幼苗ABA受體基因表達Fig.6　Expression of ABA receptor gene of alfalfa under 150 g/L PEG stress

3　討 論

滲透脅迫對植物生理以及生長的影響非常復雜，研究植物在滲透逆境下的生理反應，有助于更好地理解植物生長與環境脅迫之間的相互關系，也對研究植物生理性狀有重要意義。植物的抗旱性是植物長期適應環境形成的一種抗旱機制，是對干旱環境的抵抗能力，是多重因素相互作用形成的綜合性狀。抗旱性在本質上都與外界環境的每個因子存在一定聯系[17-19]。幼苗期是植物生長的一個重要階段，這一時期，植物對外界水分條件比較敏感，水分脅迫不僅對植物幼苗的生存有一定威脅，還對后期植物的生長發育造成影響，使植物地上和地下生長受到抑制。王珊等[20]認為干旱脅迫下桔梗地上部分和地下部分干質量下降，抑制生物量的積累；周雪潔等[21]對干旱脅迫下甘草幼苗生理特性的研究發現其相對含水量在脅迫3 d后顯著減少；劉繼明等[22]認為干旱條件下小蓬竹幼苗體內脯氨酸質量分數升高，且隨干旱條件的加劇，脯氨酸質量分數持續積累。本試驗結果也表明150 g/L PEG-6000滲透脅迫下不同品種紫花苜蓿地下部分根的生長受到顯著抑制，并且隨著脅迫時間延長，植物也對滲透脅迫產生響應，苜蓿的地上部分生長也受到抑制，使其苗長縮短，鮮干比下降，相對含水量顯著降低；但其葉片中脯氨酸質量分數顯著升高，提高苜蓿對干旱的抵抗能力。‘WL168’在滲透脅迫下根長、苗長、鮮干比和相對含水量變化最小，脯氨酸質量分數增加最大，為最抗旱品種。

ABA是植物體內一種重要激素，它對植物抵抗逆境脅迫有重要作用。大量研究表明，當植物受到外界環境脅迫時，植物體內會迅速積累大量ABA。逆境脅迫能夠增加葉綠體膜對ABA的通透性，并使根系快速合成ABA運輸至葉片[23-25]。ABA能夠調節氣孔開閉，減少蒸騰失水從而緩解干旱，同時它還能引起相關基因表達，這對植物抵抗逆境起關鍵作用[26]。本試驗通過檢測干旱脅迫下9種受體基因的表達，發現 Medtr1g016480和 Medtr5g083270的表達量顯著高于其他基因，表明 Medtr1g016480和 Medtr5g083270在ABA調控系統中起重要作用，苜蓿通過 Medtr1g016480和 Medtr5g083270的表達來調控植物抵抗外界環境脅迫。滲透脅迫下，植物根系最先對干旱脅迫作出響應，主要通過生長抑制、滲透調節、膜結構與功能改變及活性氧等次生代謝物的合成來調節[27-28]。本試驗結果也表明，滲透脅迫下9種ABA受體基因在體內表達順序為根>葉>莖。說明在干旱條件下，植物先在根中產生ABA信號，通過莖的運輸，最后在葉中積累。

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