海島棉 GbTCP5基因沉默和過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化

王　怡，范　琪，于月華，梁承娟，陳全家，曲延英，倪志勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊　830052)

TCP蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含1個(gè)TCP結(jié)構(gòu)域，含59個(gè)氨基酸(AA)殘基的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)，可以與DNA 結(jié)合或者與蛋白質(zhì)互作[1-2]。在許多植物物種中TCP蛋白進(jìn)化保守，并且參與植物從種子萌發(fā)到營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)直至形成花和果實(shí)的過(guò)程。TCP轉(zhuǎn)錄因子是重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠?qū)⒍喾N內(nèi)源性和環(huán)境信號(hào)轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。根據(jù)氨基酸序列的差異，TCP轉(zhuǎn)錄因子可以分為2類(Ⅰ和Ⅱ)，Ⅰ類蛋白相比Ⅱ類蛋白在TCP結(jié)構(gòu)域中有4個(gè)氨基酸的缺失[3]，這2類TCP蛋白已被證明能夠識(shí)別靶基因的富含GC含量的啟動(dòng)子序列[1,4-6]。高等植物的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活區(qū)通常富含酸性氨基酸序列區(qū)域、谷氨酰胺區(qū)域以及脯氨酸結(jié)構(gòu)區(qū)域[7]。目前，許多TCP蛋白能夠作為激活子或抑制子調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。

基因沉默是真核生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種重要手段，人工miRNA技術(shù)是通過(guò)內(nèi)源miRNA序列結(jié)構(gòu)特征產(chǎn)出21 bp目的miRNA，替換內(nèi)源miRNA前體的miRNA-miRNA*的序列[8]。MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶基因mRNA上的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合來(lái)介導(dǎo)mRNA的降解或翻譯抑制[9]，從形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體中產(chǎn)生[10-11]。小RNA不僅來(lái)源于外源核酸，如病毒和轉(zhuǎn)基因，而且來(lái)源于內(nèi)源性基因位點(diǎn)，作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控因子，近年來(lái)的大量研究揭示了miRNAs在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及環(huán)境適應(yīng)性方面廣泛且關(guān)鍵的作用[10,12]。Khraiwesh等[13]以缺失 DICER-LIKE1b基因小立碗蘚突變體為材料，對(duì)miRNA豐度進(jìn)行研究表明，成熟miRNA的靶mRNAs不僅沒(méi)發(fā)生切割，而且靶mRNAs的轉(zhuǎn)錄本水平也明顯降低。其原因是這些突變體積累miRNA，形成靶標(biāo)RNA雙聯(lián)體，接著編碼靶mRNAs的基因過(guò)度甲基化，最后發(fā)生沉默。本研究構(gòu)建海島棉 GbTCP5基因沉默和過(guò)量表達(dá)植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，為深入研究海島棉 GbTCP5基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　海島棉 GbTCP5基因植物過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建

1.1.1植物材料哥倫比亞野生型擬南芥col-o(Arabidopsisthaliana)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2質(zhì)粒及菌株質(zhì)粒pCAMBIA3301提供載體骨架，含有 GbTCP5基因的克隆載體pGEM-T Easy和根癌農(nóng)桿菌菌株(GV3101)均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3海島棉 GbTCP5基因的PCR擴(kuò)增及植物表達(dá)載體的構(gòu)建使用帶有酶切位點(diǎn)BglⅡ和PmlⅠ的引物，以質(zhì)粒pGEM-T Easy-GbTCP5為模板，利用TransStartTMTaqDNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序參照說(shuō)明書(shū)。引物序列為3301-GbTCP5-F:5′GAAGATCTTCATGA- TCTCGAGTTCAAGGGAAGC3′；3301-GbTCP 5-R:5′CGCACGTGCGTCATCGTTTTGTGTATGAGTGAGGC3′(下劃線表示酶切位點(diǎn))。利用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和PmlⅠ對(duì)載體pCAMBIA3301和基因片段雙酶切后再進(jìn)行連接，雙酶切體系如下：BglⅡ和PmlⅠ各1 μL，質(zhì)粒模板10 μL，10×buffer 5 μL，補(bǔ)充水至50 μL，37 ℃水浴1 h。連接體系參照相關(guān)說(shuō)明書(shū)。采用菌液PCR的方法鑒定獲得陽(yáng)性克隆，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。提取植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-GbTCP5質(zhì)粒，利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，菌液PCR檢測(cè)。

1.1.4擬南芥轉(zhuǎn)化及鑒定利用農(nóng)桿菌浸染法將pCAMBIA3301-GbTCP5轉(zhuǎn)化擬南芥col-o野生型，收獲轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株種子，將T0代收獲的種子均勻撒播于混合土[V(營(yíng)養(yǎng)土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=1∶1∶1]中，培養(yǎng)至長(zhǎng)出2片葉片時(shí)，噴除草劑進(jìn)行陽(yáng)性植株篩選?？剐灾仓昕赡転門1代植株。

1.2　海島棉 GbTCP5基因沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

利用在線網(wǎng)站W(wǎng)MD3(http://wmd3.weigel world.org/cgi-bin/web app.cgi? page=Oligo;project=stdwmd)設(shè)計(jì)置換PCR引物，擴(kuò)增GbTCP5的miRNA和miRNA*序列。在擬南芥At-MIR319前體擴(kuò)增引物319-3301-F/R兩端分別添加NcoⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便亞克隆至植物表達(dá)載體pCAMBIA3301中，引物序列為TCP5-I miR*s GATTTATCTCTGTCACCTGGCATTCTCTCTTTTGTATTCC；TC P5-II miR*a GAATGCCAGGTGACAGAGAT- AAATCAAAGAGATCAATGA；TCP5-III miR*sGAATACCAGGTGACACAGATAATTCAC-AGGTCGTGATATG；TCP5-IVmiR*a GAATTATCTGTGTCACCTGGTATTCTACATAT-ATTCCT。

以At-miR319-pGM-T質(zhì)粒為模板，使用TransStartTMTaqDNA聚合酶，用319-3301-F和TCP5-IVmiR*a，TCP5-IIImiR*s和TCP5-IImiR*a，TCP5-ImiR*s和319-3301-R 3組引物分別擴(kuò)增a、b、c片段，凝膠回收3條條帶，用3條條帶的混合物為模板，使用TransStartTMTaqDNA 聚合酶，用319-3301-F/R引物擴(kuò)增置換后的amiRNA的前體片段，PCR擴(kuò)增體系和程序參照Schwab等[14]的方法。凝膠回收amiRNA前體片段，通過(guò)TA克隆，連接至pGEM-T Easy載體中，經(jīng)菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證amiRNA前體序列的正確性。

利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BglⅡ?qū)miRGbTCP5-pGEM-T Easy和載體pCAMBIA3301雙酶切后并連接，酶切連接體系參照說(shuō)明書(shū)，經(jīng)菌液PCR和測(cè)序檢測(cè)載體構(gòu)建的正確性。

2　結(jié)果與分析

2.1　 GbTCP5基因植物過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增 GbTCP5片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物擴(kuò)增大小945 bp(圖1左)。將pCAMBIA3301-GbTCP5轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定(圖1右)，表明該植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

M1.DL2000 marker;1.pCAMBIA3301-GbTCP5；M2.DL2000 marker;1～8.農(nóng)桿菌菌液PCRAgrobacteriumtumefaciensliquid PCR

圖1pCAMBIA3301-GbTCP51PCR產(chǎn)物電泳分析(左)和pCAMBIA3301-GbTCP5表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定(右)
Fig.1ElectrophoresisanalysisofGbTCP5-pCAMBIA3301(left)andPCRidentificationofAgrobacteriumtumefaciensexpressingvectorpCAMBIA3301-GbTCP5(right)

2.2　轉(zhuǎn) pCAMBIA3301- GbTCP5基因擬南芥的篩選和檢測(cè)

除草劑噴灑結(jié)果表明，獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株(圖2)。Bar基因和目的基因PCR檢測(cè)表明，成功獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(圖3)。

圖2　轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選Fig.2　Screening of transgenic Arabidopsis

M1.DL2000 marker；M2.DL2000 marker；1～7.不同株系轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CRTransgenicArabidopsisthalianPCR

圖3轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR
Fig.3TransgenicArabidopsisbacteriaPCR

2.3　 GbTCP5基因植物沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

利用置換PCR的方法，分別獲得置換 At-MIR319的miRNA和miRNA*序列的 amiRGbTCP5 3個(gè)片段a、b、c，大小分別為118、176和178 bp(圖4左)。以a、b、c 3個(gè)片段混合為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得大小為422 bp的 amiRGbTCP5前體序列(圖4右)。

將 amiRGbTCP5前體序列亞克隆至pGEM-T Easy載體中，菌液PCR和測(cè)序結(jié)果表明獲得了替換 At-MIR319的miRNA和miRNA*序列的amiRGbTCP5。菌液PCR(圖5右)和測(cè)序結(jié)果表明獲得amiRGbTCP5-pCAMBIA3301重組質(zhì)粒。

M1.DL2000 marker；a、b、c amiRGbTCP5片段PCR產(chǎn)物M2.DL2000 marker；1. amiRGbTCP5前體序列

圖4amiRGbTCP5片段PCR產(chǎn)物(左)和amiRGbTCP5前體序列PCR產(chǎn)物(右)
Fig.4amiRGbTCP5fragmentPCRproduct(left)andamiRGbTCP5precursorPCRproduct(right)

M1.DL2000 marker；1～6.amiRGbTCP5-PGEM-T Easy PCR產(chǎn)物amiRGbTCP5-PGEM-T PCR product;M2.DL2000 marker；1～7.amiRGbTCP5-pCAMBIA3301重組質(zhì)粒菌液PCR菌液amiRGbTCP5-pCAMBIA3301 recombinant plasmid PCR

圖5PCR檢測(cè)amiRGbTCP5-PGEM-T重組質(zhì)粒(左)和PCR檢測(cè)amiRGbTCP5-pCAMBIA3301重組質(zhì)粒(右)
Fig.5PCRdetectionofrecombinantplasmidamiRGbTCP5-PGEM-TEasy(left)andPCRdetectionofrecombinantplasmidamiRGbTCP5-pCAMBIA3301(right)

3　討 論

TCP基因是由玉米(Zea)的 TEOSINTE BRANCHED1(TB1)、金魚(yú)草(Antirrhinum)的 CYCLOIDEA(CYC)，水稻(Oryza)中的 PROLIFERRATING CELL FACTORS 1(PCF1)和 PROLIFERRATING CELLFACTORS 2(PCF2)的第1個(gè)英文字母構(gòu)成了它的名字TCP[15]。TCP轉(zhuǎn)錄家族已在許多植物中被發(fā)現(xiàn)，并且它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成以及對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用[16]。在許多基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制中，轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是非常重要的。轉(zhuǎn)錄因子可以與特定的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活或抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[17-19]。

前人研究發(fā)現(xiàn)一些TCP轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控棉花纖維的發(fā)育進(jìn)程。例如，Hao等[20]從海島棉纖維cDNA文庫(kù)中克隆了1個(gè)GbTCP轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中過(guò)表達(dá)GbTCP基因，能夠增強(qiáng)根毛的起始和伸長(zhǎng)，調(diào)控分支；進(jìn)一步研究顯示GbTCP正調(diào)控茉莉酸水平，且激活纖維和根毛伸長(zhǎng)必需的一些下游基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，GbTCP是一個(gè)纖維和根毛發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中異源表達(dá) GhTCP14導(dǎo)致生長(zhǎng)素水平和分配發(fā)生改變，影響根和表皮細(xì)胞的起始和伸長(zhǎng)。以上研究表明TCP基因在棉花纖維伸長(zhǎng)中具有重要的作用。本研究構(gòu)建海島棉 GbTCP5過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，得到轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)該基因功能的研究具有重要的價(jià)值。

重疊延伸PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，不僅可以應(yīng)用于擴(kuò)增長(zhǎng)片段基因、定點(diǎn)突變和基因敲除等，而且在定點(diǎn)突變上的應(yīng)用具有突變效率高、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)[22]。運(yùn)用人工miRNA技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體可以使其他物種的miRNA在模式植物擬南芥中產(chǎn)生[14]。本研究利用重疊延伸PCR構(gòu)建 GbTCP5基因沉默表達(dá)載體，為進(jìn)一步分析該基因功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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