密旋鏈霉菌Act12遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立與優(yōu)化

李曉霞 ，馬怡茗，文冰潔，舒?zhèn)W(xué)，薛泉宏，賈良輝 ，顏　華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌　712100; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 環(huán)境資源學(xué)院，陜西楊凌　712100)

鏈霉菌(Streptomyces)是一類高G+C 含量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能夠產(chǎn)生種類繁多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如抗生素、色素、酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等。目前所發(fā)現(xiàn)的12 000 余種天然抗生素中約2/3由鏈霉菌產(chǎn)生，其中許多已在人類醫(yī)藥(如抗腫瘤等)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中體現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。

密旋鏈霉菌(Streptomycespactum)Act12是西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院薛泉宏教授從青藏高原土壤中分離到的1株鏈霉菌[3]。前期研究表明，Act12對(duì)6種土傳病原真菌木賊鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、尖孢鐮刀菌西瓜專化型、芬芳鐮刀菌、尖孢鐮刀菌棉花專化型、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型均有拮抗作用[4]；對(duì)蘋果腐爛菌、油菜菌核菌等多種植物病原菌也有很強(qiáng)的抑制作用，具有良好的生防應(yīng)用潛質(zhì)。同時(shí)，Act12對(duì)草莓[3]、甜瓜[5]、魔芋[6]等作物有良好的促生作用，并能增強(qiáng)魔芋的抗病能力。目前的研究主要集中在Act12的生防及促生的理化試驗(yàn)方面，對(duì)其具體的分子機(jī)理研究甚少。而要研究其分子機(jī)理并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用，首要條件則是建立合適的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

鏈霉菌中常用的外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入的方法有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化以及接合轉(zhuǎn)移。鏈霉菌通常有很強(qiáng)的限制修飾系統(tǒng)[6]，接合轉(zhuǎn)移由于操作相對(duì)簡(jiǎn)便，外源基因不易受到宿主的限制性修飾[7]，較常用于鏈霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化。大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移的方法在1989年首次報(bào)道[8]，特別是在使用甲基化缺陷型大腸桿菌作為供體以及大量大腸桿菌鏈霉菌穿梭質(zhì)粒被成功構(gòu)建后[9]，該方法被進(jìn)一步優(yōu)化，廣泛應(yīng)用于鏈霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化操作。由于接合轉(zhuǎn)移過(guò)程中涉及多種因素，而不同的鏈霉菌種又有不同的特性，所以針對(duì)不同的鏈霉菌種，甚至鏈霉菌株，往往需要對(duì)接合轉(zhuǎn)移條件進(jìn)行改進(jìn)與優(yōu)化，達(dá)到將外源遺傳物質(zhì)高效導(dǎo)入的目的。近年來(lái)，仍有大量鏈霉菌通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法成功構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，如xinaomycins產(chǎn)生菌諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)[10]，Toyocamycin產(chǎn)生菌淀粉產(chǎn)色鏈霉菌1628(Streptomycesdiastatochromogenes1628)[11]，Streptovaricin產(chǎn)生菌壯觀鏈霉菌NRRL2994(StreptomycespectabilisNRRL2994)[12],以及Azalomycin F產(chǎn)生菌鏈霉菌211726[13]遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建。

在對(duì)Act12進(jìn)行全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其中有大量可能的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，包括：PKSⅠ(Ⅰ型聚酮合酶)、PKSⅡ(Ⅱ型聚酮合酶)、NRPS(非核糖體肽)、Lassopeptide(套索肽)、Terpene(萜類)生物合成基因簇等。為了對(duì)其展開(kāi)研究，進(jìn)而探討其活性機(jī)理，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)接合轉(zhuǎn)移過(guò)程涉及的多個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了Act12的高效遺傳操作系統(tǒng)。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1菌株與質(zhì)粒試驗(yàn)所用菌株：受體菌為密旋鏈霉菌Act12，供體菌為大腸桿菌S17-1，質(zhì)粒克隆宿主菌為DH5a。

本研究所用質(zhì)粒：pSET152為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭整合型質(zhì)粒，帶有阿普霉素抗性基因[9]；pMD18-T載體帶有Amp抗性，購(gòu)于TAKARA公司; pKC1139溫敏穿梭質(zhì)粒，帶有Apr抗性，在大腸桿菌中39 ℃不能自主復(fù)制[9]。

1.1.2培養(yǎng)基和抗生素Act12的固體培養(yǎng)為高氏一號(hào)，液體培養(yǎng)為TSB[14]；接合轉(zhuǎn)移使用的培養(yǎng)基有：高氏一號(hào)、2CMY，改良2CMY、GSY、MS、MS(+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的KNO3)以及MS(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% 的MgSO4)[15]；孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基為2×YT[15]；接合子傳代和篩選使用的培養(yǎng)基分別為高氏一號(hào)和TSB[15]；發(fā)酵培養(yǎng)基為SPY(胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%，酵母提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%，pH=7.2)；大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B。

抗生素使用的質(zhì)量濃度為：卡那霉素(Kan) 50 mg/L, 阿普霉素(Apr) 50 mg/L ，萘啶酮酸25 mg/L，氨芐青霉素(Amp)100 mg/L。

1.2　方 法

1.2.1抗生素耐受測(cè)定選取卡那霉素、阿普霉素、紅霉素、潮霉素以及萘啶酮酸5種抗生素分別加入固體高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，至質(zhì)量濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 mg/L。劃線接種Act12孢子在28 ℃培養(yǎng)10 d。觀察菌種生長(zhǎng)情況。

1.2.2常用的分子生物學(xué)方法大腸桿菌轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取參照分子克隆指南[16]；鏈霉菌基因組DNA提取參考鏈霉菌操作手冊(cè)[15]。

1.2.3接合轉(zhuǎn)移將穿梭整合型質(zhì)粒pSET152通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1中，得到供體菌S17-1/pSET152。挑取單克隆接種于5 mL LB液體試管中(含Apr 50 mg/L、Kan 50 mg/L)，37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)后按照體積比1∶100的比例接種于40 mL的 LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min至OD600為0.4～0.6，離心收集菌體，并用等體積的新鮮LB液體清洗菌體2次，然后將菌體懸浮于0.5 mL的LB培養(yǎng)基中備用。同時(shí)刮取在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)8 d的新鮮Act12孢子，放入加有玻璃珠及10 mL無(wú)菌水的100 mL錐形瓶中，28 ℃搖床上振搖30 min破碎孢子，然后用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾后7 000 r/min離心10 min后倒掉上清，用0.5 mL的2×YT重懸孢子，45～55 ℃熱激10 min預(yù)萌發(fā)后，37 ℃、150 r/min萌發(fā)2～3 h。將備用的大腸桿菌和萌發(fā)好的Act12孢子按照體積比1∶1的比例混合，每150 μL涂布于接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)16～20 h后涂布萘啶酮酸(質(zhì)量濃度25 mg/L)和阿普霉素(質(zhì)量濃度1～10 mg/L), 28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d后可觀察接合子。本試驗(yàn)中供體大腸桿菌數(shù)量保持108不變，受體Act12孢子量從105～108以10倍遞增。以肉眼可分辨的接合子為準(zhǔn)，接合效率用接合子數(shù)除以孢子量表示，數(shù)據(jù)取3次試驗(yàn)平均值。

1.2.4PCR驗(yàn)證接合子長(zhǎng)出的接合子在帶有抗性的高氏一號(hào)培養(yǎng)基上抗性交替?zhèn)鞔?次后接種于TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，提取基因組DNA作為PCR模版。根據(jù)pSET152質(zhì)粒上帶有的Apr抗性基因設(shè)計(jì)上下游引物，以Act12基因組DNA為陰性對(duì)照模版，pSET152質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照模版，擴(kuò)增Apr抗性基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列如下：AMF 5′-3′ GGTTCATGTGCAGCTCCATCAGC；AMR 5′-3′ ATGAGCTCAGCCAATCGACTGG[17]。

1.2.5 敲除突變株 Δspa0520的獲得與篩選通過(guò)antiSMASH網(wǎng)站分析Act12全基因組草圖序列，找到一個(gè)預(yù)測(cè)為L(zhǎng)assopeptide的基因簇，對(duì)該基因簇內(nèi)的基因進(jìn)行分析，推測(cè)其中的TetR家族調(diào)控基因 spa0520可能為負(fù)調(diào)控基因，嘗試用同源重組的方法將該基因阻斷使其不能表達(dá)，看能否激活這個(gè)基因簇，從而產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

從pET28a載體上擴(kuò)增得到kanamycin抗性基因片段，連入pMD18-T載體測(cè)序正確后得到pMD18-T-Kan質(zhì)粒載體。

設(shè)計(jì)上游同源片段引物：

spa0520-U-F(p1)(EcoRI) 5′-3′GGAATTCCCGGGAAGATCAACCTCGA；

spa0520-U-R(p2)(XbaI) 5′-3′ GCTCTAGAGCCGCTTACAGCGCCTTTG。

PCR擴(kuò)增得到 spa0520基因上游同源片段即為U，用EcoRⅠ和XbaⅠ分別雙酶切pMD18-T-Kan質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增得到的片段U，得到帶有EcoRⅠ和XbaⅠ粘性末端的線性pMD18-T-Kan和U片段，使用T4連接酶將其進(jìn)行連接，得到pMD18-T-Kan-U質(zhì)粒。

設(shè)計(jì)下游同源片段引物：

spa0520-D-F(p3)(PstⅠ)5′-3′ AACTGCAGGACGGGAGGGGAGCCCCTT； spa0520-D-R(p4)(HindⅢ)5′-3′ CCCAAGCTTGACACCGTCGTCGTCTGCT。

PCR擴(kuò)增得到 spa0520基因下游的同源片段即為D，用PstⅠ和HindⅢ分別雙酶切pMD18-T-Kan-U質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增得到的片段D，得到帶有PstⅠ和HindⅢ粘性末端的線性pMD18-T-Kan-U和D片段，使用T4連接酶連接得到pMD18-T-Kan-U-D質(zhì)粒。使用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pMD18-T-Kan-U-D和pKC1139質(zhì)粒，得到線性的pKC1139和U-Kan-D片段，連接后即得用于基因敲除的質(zhì)粒pKC1139-U-Kan-D，命名為pKT0520質(zhì)粒。

將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKT0520的大腸桿菌S17-1與Act12通過(guò)大腸桿菌-鏈霉菌之間的接合轉(zhuǎn)移技術(shù)，成功地將重組質(zhì)粒pKT0520轉(zhuǎn)至Act12中，獲得相關(guān)接合子，該接合子可在含有卡那霉素(質(zhì)量濃度為10 mg/L)、阿普霉素(質(zhì)量濃度為10 mg/L)和萘啶酮酸(質(zhì)量濃度為25 mg/L)的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上篩選獲得，培養(yǎng)溫度為28 ℃。刮取長(zhǎng)勢(shì)良好的接合子孢子，利用劃線稀釋法涂布于含有卡那霉素和萘啶酮酸的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上，置于40 ℃培養(yǎng)。由于pKC1139的溫敏型復(fù)制子在高于39 ℃時(shí)不能復(fù)制，迫于選擇壓力重組質(zhì)粒pKT0520依靠同源臂與宿主染色體發(fā)生同源重組整合到宿主Act12染色體上(圖1)，從而獲得相關(guān)雙交換敲除突變菌株。

圖1　敲除質(zhì)粒pKT0520 與Act12染色體同源區(qū)域發(fā)生雙交換的示意圖Fig.1　Schematic diagram of gene replacement between plasmid pKT0520 and chromosomes of Act12

將溫敏篩選獲得的單克隆敲除子傳代至含有卡那霉素的高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后將長(zhǎng)勢(shì)良好的敲除子印記到安普霉素抗性平板上，篩選獲得安普霉素敏感的雙交換突變株 Δspa0520，最后用相關(guān)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.6菌株發(fā)酵與代謝產(chǎn)物分析收集Act12及突變株 Δspa0520的新鮮孢子接種于100 mL的TSB種子培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h；按體積比1∶10的比例轉(zhuǎn)種于200 mL的SPY發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d后。將發(fā)酵物按體積比1∶1的比例用乙酸乙酯萃取3次，收集上層有機(jī)相并將上層有機(jī)相利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至干，濃縮獲得的萃取物溶于1 mL甲醇，并用0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾除菌，用于后續(xù)的HPLC檢測(cè)。HPLC條件：C18反向柱； 流動(dòng)相A為水，B為甲醇，梯度洗脫(0～5 min，10% B；5～35 min，10%～100% B；35～45 min，B；45～50 min，100%～10% B)(體積比)；流速1 mL/min；進(jìn)樣量25 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1　密旋鏈霉菌Act12對(duì)抗生素的敏感性測(cè)試

為了確定可用于密旋鏈霉菌Act12遺傳轉(zhuǎn)化操作的抗性選擇標(biāo)記，分別檢測(cè)Act12對(duì)卡那霉素、阿普霉素、紅霉素、潮霉素的耐受度。另外，為保證萘啶酮酸在抑制大腸桿菌時(shí)不會(huì)對(duì)Act12的生長(zhǎng)有影響，同時(shí)測(cè)定Act12對(duì)萘啶酮酸的耐受度。結(jié)果如表1所示，Act12對(duì)阿普霉素和卡那霉素非常敏感，在質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的阿普霉素和卡那霉素平板上不能生長(zhǎng)；對(duì)潮霉素比較敏感，在質(zhì)量濃度為4.0 mg/L的潮霉素平板上不能生長(zhǎng)；對(duì)紅霉素和萘啶酮酸不敏感，在質(zhì)量濃度為25.0 mg/L的紅霉素和萘啶酮酸平板上可以生長(zhǎng)。表明阿普霉素和卡那霉素抗性基因可以用來(lái)作為Act12遺傳操作的抗生素選擇標(biāo)記。

2.2　接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的選擇

試驗(yàn)選擇7種不同的接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，分別是高氏一號(hào)、2CMY，改良2CMY(+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% KNO3)、GSY、MS、MS(+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%KNO3)以及MS(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%MgSO4)。其中高氏一號(hào)是Act12生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基，而2CMY、GSY和MS是3種比較經(jīng)典的接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，其余幾種培養(yǎng)基則是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其進(jìn)行了適當(dāng)改良。

結(jié)果(表2)表明，無(wú)論是原始的MS培養(yǎng)基，還是2種改良后的MS培養(yǎng)基，均沒(méi)有接合子長(zhǎng)出。在改良2CMY、GSY、高氏一號(hào)培養(yǎng)基上可以長(zhǎng)出接合子，其中改良2CMY的接合子數(shù)量最多；GSY接合子生長(zhǎng)旺盛與大腸桿菌混在一起，難以挑取單菌落；高氏一號(hào)上面接合子數(shù)量較少。因此，選擇改良2CMY培養(yǎng)基作為接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。

表1　密旋鏈霉菌Act12對(duì)不同抗生素的敏感性Table 1　Sensitivity of Streptomyces pactum Act12 to antibiotics

注：“-” Act12不生長(zhǎng)；“+”Act12生長(zhǎng)微弱；“++”Act12生長(zhǎng)良好。

Note:“-” Act12 don’t grow；“+”Act12 growth is weak；“++”Act12 grows well.

2.3　熱激溫度及時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響

熱激處理的目的是為了促進(jìn)孢子預(yù)萌發(fā)，孢子預(yù)萌發(fā)是影響接合效率的一個(gè)重要因素。試驗(yàn)中選取45 ℃、50 ℃、55 ℃，每個(gè)溫度分別熱激處理5 min、10 min、15 min，然后在37 ℃搖床上萌發(fā)2.5 h。結(jié)果見(jiàn)表3～4：在50 ℃ 熱激10 min的預(yù)萌發(fā)條件下接合效率最高為2.079×10-5。當(dāng)溫度在55 ℃時(shí)并沒(méi)有接合轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。因此，確定孢子最佳預(yù)萌發(fā)條件為50 ℃熱激10 min。

表2　密旋鏈霉菌Act12在不同培養(yǎng)基上的接合轉(zhuǎn)移效率Table 2　Conjugation transfer efficiency of Streptomyces pactum Act12 on different media

2.4　接合轉(zhuǎn)移時(shí)間和抗生素濃度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響

接合轉(zhuǎn)移時(shí)間選擇3個(gè)時(shí)間段(表5)，分別為16 h、18 h和20 h。將供體大腸桿菌和受體孢子等體積混合涂布在接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基之后，在28 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)16 h、18 h和20 h，然后涂布萘啶酮酸(質(zhì)量濃度25 mg/L)和適量的阿普霉素。阿普霉素質(zhì)量濃度選擇4個(gè)梯度，分別為0、3 mg/L、6 mg/L、10 mg/L。涂布抗生素后繼續(xù)在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。不同接合轉(zhuǎn)移時(shí)間和抗生素濃度下的接合轉(zhuǎn)移結(jié)果分別見(jiàn)表5和表6。

由結(jié)果可知，Act12的接合轉(zhuǎn)移最適時(shí)間是18 h。最適Apr抗生素質(zhì)量濃度是10 mg/L。

表3　熱激溫度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Table 3　Influence of heat temperature on conjugation frequency

表4　熱激時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Table 4　 Influence of heat time on conjugation frequency

表5　接合轉(zhuǎn)移時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Table 5　Influence of conjugate transfer time on conjugation frequency

表6　抗生素質(zhì)量濃度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Table 6　Influence of antibiotics mass concentration on conjugation frequency

2.5　接合子的驗(yàn)證

通過(guò)優(yōu)化后的方法，質(zhì)粒pSET152能以較高的效率轉(zhuǎn)入Act12中。由于pSET152是整合型質(zhì)粒，需要整合到Act12的基因組上才能獲得穩(wěn)定的接合子。隨機(jī)挑選接合子，在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后收集菌絲體，提取基因組DNA，用阿普抗性基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以野生型Act12基因組DNA為陰性對(duì)照模版，pSET152質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照模版。PCR結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，質(zhì)粒pSET152和接合子DNA均擴(kuò)增出Apr抗性基因的條帶，而野生型Act12基因組DNA未擴(kuò)增出條帶,由此可以證明pSET152已成功轉(zhuǎn)入Act12中。

P.質(zhì)粒pSET152的PCR驗(yàn)證產(chǎn)物PCR-amplified bands of plasmid pSET152；Wt.野生型Act12基因組DNA的PCR驗(yàn)證產(chǎn)物PCR-amplified bands of wild-type Act12 genetic DNA；M.DL2000 maker；1～3.接合子的PCR驗(yàn)證產(chǎn)物PCR-amplified bands of exconjugants

圖2接合子的PCR驗(yàn)證
Fig.2PCRidentificationofexconjugants

為了驗(yàn)證接合子的遺傳穩(wěn)定性，隨機(jī)挑選100個(gè)接合子在只加入萘啶酮酸和加入萘啶酮酸以及阿普霉素的高氏一號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性交替?zhèn)鞔瑐鞔?次后接合子仍生長(zhǎng)良好，沒(méi)有出現(xiàn)抗性消失的菌落。再挑取10個(gè)接合子接入加有萘啶酮酸和阿普霉素的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均可以生長(zhǎng)，提取總DNA，經(jīng)PCR驗(yàn)證后與之前的接合子驗(yàn)證結(jié)果一致。表明pSET152質(zhì)粒可以在Act12中穩(wěn)定遺傳。

2.6　 spa0520基因的敲除與驗(yàn)證

通過(guò)溫敏篩選得到雙交換的 spa0520基因缺失突變株 Δspa0520。提取相關(guān)基因組DNA，使用引物 spa0520-U-F(p1)和 spa0520-D-R(p4)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR相關(guān)驗(yàn)證表明 spa0520基因的雙交換缺失突變株構(gòu)建成功。

圖3中，Act12對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增條帶大約為1.8 kb，而 spa0520基因缺失突變株 Δspa0520對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增條帶大約為2.2 kb，PCR試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符(圖1)，證實(shí) spa0520基因缺失突變株 Δspa0520構(gòu)建成功。

圖3　PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 spa0520基因缺失突變株Fig.3　PCR amplification of spa0520 deleted mutant

2.7　突變株次級(jí)代謝產(chǎn)物變化分析

野生型Act12和突變株 Δspa0520的發(fā)酵液HPLC分析結(jié)果見(jiàn)圖4。HPLC檢測(cè)結(jié)果表明：在出峰時(shí)間30 min的位置，突變株 Δspa0520對(duì)應(yīng)的吸收峰顯著增強(qiáng)，對(duì)應(yīng)的化合物命名為X；通過(guò)積分面積求得X的產(chǎn)量較之于野生型Act12的產(chǎn)量提高了6倍。基因敲除試驗(yàn)結(jié)果表明，在Act12中 spa0520基因?qū)衔颴的生物合成起負(fù)調(diào)控作用。

此外，利用濾紙片法對(duì)Act12和 Δspa0520的發(fā)酵萃取液的抑菌活性進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，突變株 Δspa0520較之于野生型Act12對(duì)蘋果腐爛病菌、核桃潰瘍病菌、油菜菌核病菌和小麥根腐病菌的拮抗活性明顯增強(qiáng)，本試驗(yàn)結(jié)果預(yù)示著化合物X可能具有抗真菌活性；為此筆者將化合物X進(jìn)行分離純化，最后鑒定化合物X為寡霉素D。已有研究表明寡霉素D具有良好的抗真菌活性，這與本試驗(yàn)所涉及的有關(guān)發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果相吻合(該部分試驗(yàn)結(jié)果另文發(fā)表)。

圖4　Act12和 Δspa0520發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.4　HPLC chromatograms of fermentation broth from Act12 and Δspa0520

3　討 論

本試驗(yàn)以密旋鏈霉菌Act12為出發(fā)菌株，建立其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)并進(jìn)行了優(yōu)化，為后期研究其機(jī)理并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其應(yīng)用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。鑒于接合轉(zhuǎn)移具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)優(yōu)先利用接合轉(zhuǎn)移法建立其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

Act12遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，促使對(duì)其進(jìn)行遺傳操作成為可能，這為后續(xù)對(duì)Act12進(jìn)行機(jī)理研究以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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