不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用

谷祖敏，畢　卉，張　兵，田曉穎

(沈陽農業大學 植物保護學院，沈陽　110161)

黃瓜枯萎病[Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum]在露地和保護地栽培黃瓜上均可發生，連作地區尤為嚴重，現已成為世界范圍內影響黃瓜生產的毀滅性土傳病害，發病率一般為 20%～30%，受害重的地區發病率高達 80%～90%以上，甚至絕產[1]。化學農藥的大量使用在防治植物土傳病害的同時，也殺死環境中的有益微生物，嚴重破壞農業生態系統，造成環境污染。木霉菌是一種防治蔬菜土傳病害的理想生防資源，國內外已有很多關于利用木霉菌防治瓜類枯萎病的報道[2-5]。

不同生防木霉菌對不同植物病原真菌表現不同的作用方式，國內外關于不同種類的木霉菌株對同一種病原菌的拮抗作用鮮見報道。本試驗通過比較不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌在競爭作用、重寄生作用、抗生作用和防病作用方面的差異，篩選出高效生防菌株，以期為利用木霉菌防治土傳病害提供依據。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

生防菌株：長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)TL菌株、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)TH菌株、綠色木霉(Trichodermaviride)TV菌株、康寧木霉(Trichodermakoningi)TK菌株；致病菌：尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)，均由沈陽農業大學農藥科學實驗室提供。

供試培養基：PDA培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL)，用于室內抑菌試驗培養木霉菌和黃瓜枯萎病菌；玉米粉沙土培養基(玉米粉∶沙土∶水=1∶1∶0.8，質量比)，用于盆栽試驗擴繁黃瓜枯萎病菌接種物；麥麩稻殼玉米粉培養基(麥麩∶稻殼∶玉米粉=6∶1.5∶2.5，質量比)，用于盆栽試驗擴繁不同木霉菌分生孢子。

供試黃瓜種子：‘荷蘭M6’。

1.2　試驗方法

1.2.1不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌競爭作用的研究采用平板對峙法，分別將不同木霉菌株菌餅和黃瓜枯萎病菌菌餅(d=5 mm)同時接種到PDA平板上，相距約4 cm，以單獨接種黃瓜枯萎病病菌的平板為對照，重復3次，28 ℃恒溫培養 5 d，測量黃瓜枯萎病菌的菌落直徑。以木霉菌株對黃瓜枯萎病菌菌絲擴展的抑制率評價競爭作用。

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.5)×100%

1.2.2不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌重寄生作用的研究參考喬宏萍等[6]的方法，用解剖刀劃取15 mm×10 mm PDA膜，置于載玻片上，挑取不同木霉菌和黃瓜枯萎病菌的菌絲分別接種于PDA膜兩端，28 ℃恒溫培養，逐日鏡檢觀察兩菌交界處菌絲生長狀況。

1.2.3不同木霉菌代謝產物對黃瓜枯萎病病菌生物活性的研究木霉菌代謝產物的制備：將木霉菌分別接種在含100 mL 發酵培養基的250 mL 三角瓶中，28 ℃，150 r/min，振蕩培養5 d。將發酵液離心去除菌絲后，取上清液以0.22 μm 無菌濾膜過濾得到木霉菌代謝產物，待用。

木霉菌代謝產物對黃瓜枯萎病菌的抗生活性：參考王革等[7]的方法，挑取黃瓜枯萎病菌的菌絲放入熔化后冷卻至40 ℃左右的PDA中，搖勻倒平板，凝固后，平板中央放置牛津杯，向牛津杯中分別加入50 μL 不同木霉菌的代謝產物，28 ℃培養3 d，測量抑菌圈直徑。

木霉菌代謝產物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用：分別取50 μL不同木霉菌代謝產物加入9 cm培養皿中，倒入熔化后冷卻至40 ℃左右的PDA，迅速混勻。凝固后，平板中央接種黃瓜枯萎病菌的菌餅(d=5 mm)，以滴加50 μL空白發酵培養基的處理作為對照，重復3次。28 ℃恒溫培養5 d，測量黃瓜枯萎菌菌落直徑。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.5)×100%

木霉菌代謝產物對黃瓜枯萎病菌孢子萌發的抑制作用：取1滴黃瓜枯萎病病菌孢子懸浮液(濃度約為1×106mL-1)加入凹玻片的凹坑中，再加1滴不同木霉菌代謝產物，混合均勻，28 ℃保濕培養，12 h 后鏡檢并統計孢子萌發率。

1.2.4不同木霉菌株對黃瓜枯萎病防病作用的研究黃瓜枯萎病菌接種物的制備：將黃瓜枯萎病菌菌餅接種至玉米粉沙土培養基中，每瓶接種4個菌餅，放入25 ℃恒溫箱培養14 d，培養基表面長滿菌絲，取出培養物，待用。

木霉菌接種物的制備：分別將不同木霉菌餅接種至麥麩稻殼玉米粉培養基，每瓶接種4個菌餅， 25 ℃恒溫培養10 d，將培養物過篩，獲得木霉分生孢子。

盆栽試驗：先將不同木霉菌分生孢子與育苗土混合(木霉濃度為108g-1)，裝入育苗盤中，播種已催芽的黃瓜種子，7 d之后移栽到裝有4%黃瓜枯萎病菌接種物的營養缽(18 cm×12 cm)中，每缽移栽3株黃瓜幼苗，以育苗土中不加木霉的處理為對照，每個處理重復5次。最后將營養缽置于溫度25 ℃、相對濕度60%～70%氣候培養箱中，14 d后調查黃瓜發病情況。

結果調查：黃瓜枯萎病的分級標準參考柏敏戰等[8]的方法，按下式計算病情指數和防病效果。病情指數=∑(各級病株數×級數)/(調查總數×最高級代表數)×100，防病效果=(對照組病情指數-處理組病情指數)/對照組病情指數×100%。將植株拔出洗凈、晾干，用剪刀沿莖基部剪開，稱量各處理地上部分鮮質量和地下部分鮮質量。地上部分鮮質量促進率=(處理組莖葉質量-對照組莖葉質量)/對照組莖葉質量×100%，地下部分鮮質量促進率=(處理組根系質量-對照組根系質量)/對照組根系質量×100%。

2　結果與分析

2.1　不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌的競爭作用

平板對峙試驗顯示，4株木霉菌對黃瓜枯萎病菌均表現競爭作用。和對照相比，同一PDA平板上接種木霉菌后明顯限制黃瓜枯萎病菌的菌絲擴展，培養后期木霉菌甚至可在黃瓜枯萎病菌的菌落上生長，并逐漸覆蓋病菌。第5天測量結果表明，TH菌株競爭作用最強，菌絲擴展抑制率為67.70%，顯著高于其他菌株；其次是TV和TL菌株，抑制率分別為54.44%和54.05%；TK競爭作用最小，抑制率為43.77%(圖1)。

圖1　不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌的競爭作用Fig.1　Competition action of different Trichoderma strains with F.oxysporum

2.2　不同木霉菌對黃瓜枯萎病菌的重寄生作用

觀察發現，不同木霉菌的菌絲能夠以多種方式寄生于病原菌的菌絲上，沿黃瓜枯萎病菌菌絲生長，并吸附于黃瓜枯萎病菌絲。其中TL和TH菌株的重寄生作用最強。如與病原菌緊貼或者纏繞在一起(圖2-A，2-B)，或穿透病原菌菌絲在其內部生長(圖2-C)。當木霉菌寄生在病原菌菌絲上時，導致病原菌菌絲發育受到影響，具體表現為病原菌菌絲斷裂，細胞膨大或者萎縮，細胞內容物外泄等(圖2-D)。

a.黃瓜枯萎病菌的菌絲　Hyphae of F.oxysporum ；b.木霉菌的菌絲　Hyphae of Trichoderma

2.3　不同木霉菌代謝產物對黃瓜枯萎病菌的生物活性

2.3.1抗生活性從圖3可以看出，培養3 d后在加有黃瓜枯萎病菌的平板上牛津杯周圍均出現清晰的透明圈，說明4株木霉菌株對黃瓜枯萎病菌病原菌均有抗生活性。其中TH菌株抗生活性最強，抑菌圈直徑達到3.9 cm，其次是TL和TV菌株，TK菌株抑菌圈直徑最小，抗生作用最弱。

2.3.2對菌絲生長的抑制作用由圖4可知，不同木霉菌株的代謝產物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長均表現抑制活性。其中TH和TL菌株代謝產物抑制作用最強，抑菌率分別為57.19%和51.61%，二者差異不顯著；其次是TV菌株。TK菌株代謝產物抑菌作用最差，抑制率僅為4.69%，顯著低于其他3個菌株。

圖3　不同木霉菌對黃瓜枯萎病菌的抗生作用Fig.3　Antibiotic effect of different Trichoderma strains against F.oxysporum

2.3.3對分生孢子萌發的抑制作用供試木霉菌的代謝產物均顯著抑制黃瓜枯萎病菌分生孢子的萌發，不同菌株抑制作用表現一定差異。TH和TL菌株抑制作用最強，抑制率分別達到68.35%和62.69%；TV菌株代謝產物對孢子萌發的抑制率為47.51%，TK的抑制率為34.15%(圖5)。

2.4　不同木霉菌對黃瓜枯萎病的防病作用

盆栽試驗結果表明，育苗時施用木霉菌株不同程度控制苗期黃瓜枯萎病的發生，TH菌株防病作用最強，防效達到64.34%，顯著高于其余木霉菌株。從表1可以看出，供試的木霉菌株還對黃瓜根系和植株生長有一定促進作用，木霉菌對幼苗生長的促進作用和對病害的防治作用并不一致。TV菌株對黃瓜生長促進作用最強，地上部分和地下部分鮮質量分別增加42.81%和86.92%，防病作用最差的TL菌株對黃瓜生長促進作用僅次于TV菌株。

圖4　不同木霉菌株代謝產物對黃瓜枯萎病菌絲生長的抑制作用Fig.4　Inhibition effect of different Trichoderma strains on mycelia growth of F.oxysporum

圖5　不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌孢子萌發的抑制作用Fig.5　Inhibition effect of different Trichoderma strains on spore germination of F.oxysporum

處理菌株Treatment病情指數Diseaseindex防效/%Controlefficiency地上部分鮮質量/gFWofovergroundpart促進率/%Promotionrate地下部分鮮質量/gFWofundergroundpart促進率/%PromotionrateTL17.73±0.266.34d25.02±0.2826.75b1.95±0.0350.00bTV9.94±0.3247.49b28.19±0.1142.81a2.43±0.0686.92aTH6.75±0.2364.34a22.99±0.0716.46c1.62±0.0324.62cTK15.66±0.4117.27c20.80±0.185.37d1.54±0.0518.46dCK18.93±0.23-19.74±0.04-1.30±0.06-

注：同列中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

3　結論與討論

木霉菌作為防治植物病害理想的生防因子，其對植物病原菌的拮抗機制主要包括競爭作用、重寄生作用、分泌具有活性的代謝產物、誘導宿主植物的自體抗性等[9]。競爭作用主要表現對生存空間和營養的競爭。試驗發現4種木霉菌株生長速度均較快，生長速度明顯快于黃瓜枯萎病菌，木霉菌甚至還可在黃瓜枯萎病菌的菌落上生長，并逐漸覆蓋病菌，最終占領整個生存空間和營養空間，完全抑制病原菌的生長繁殖。這與Sivan等[10]及Barak等[11]的研究結果基本一致，但其在植物表面或侵入位點上能否迅速占領空間阻礙病原菌的侵染還有待通過植株栽培試驗來進一步驗證。供試的4種木霉菌因其生長速度存在差異導致其在對峙培養中表現的競爭作用不同。

木霉的重寄生作用包含對病原菌的侵染、識別、接觸、纏繞、穿透和寄生等一系列過程[12]。供試的4種木霉，長枝木霉TL菌株和哈茨木霉TH菌株觀察到明顯的重寄生現象，菌株能夠通過緊貼、纏繞、穿透等方式寄生于黃瓜枯萎病菌菌絲，引起病原菌菌絲斷裂，細胞內容物外泄。木霉能否對植物病原真菌具有寄生作用可能與木霉是否產生能降解這種病原菌的細胞壁降解酶有關。

抗生作用是木霉發揮生物防治功能的重要機制[13]。木霉在代謝過程中可以產生抗菌物質阻止病原菌的定殖和抑制植物病原菌的生長而發揮其生防作用[14]。試驗中觀察到供試木霉菌的無菌代謝產物在加有指示菌的培養基上均能產生抑菌圈，而且能夠抑制黃瓜枯萎病菌的菌絲生長和孢子萌發，證明木霉菌在生長過程中產生抗菌物質。不同木霉菌抗生作用不同，可能與產生抗生素的種類和數量有關。

盆栽試驗中哈茨木霉TH菌株的防病效果最理想，這個研究結果與體外作用機制研究時該菌株對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用最強相一致。生防菌作用效果與菌株類型、病原真菌的類型，作物類型和環境條件密切相關。木霉對植物病原菌的生物防治機制具有多樣性和復雜性，往往是多種機制共同作用的結果，而不同菌株的生防機制的側重點不同。深入研究木霉的生防作用機制有助于篩選高效的木霉菌株，從而有效控制植物真菌病害的發生。

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