新疆亞麻籽油香氣指紋圖譜的構建與研究

魏長慶　周　琦　陳　卓　王永瑞　李　琳　劉文玉

(石河子大學食品學院；新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室1，石河子　832000) (油料脂質化學與營養湖北省重點實驗室2，武漢　430000)

亞麻是世界十大油料作物之一，我國亞麻種植面積約占世界亞麻種植總面積的18%，產量占世界亞麻總產量的17%[1]。亞麻油是我國西部地區老百姓最喜愛的油種之一，多采用純物理炒籽壓榨工藝制備，因而具有濃郁的香氣及豐富的營養價值[2]。然而，由于亞麻油價格高于其他常見食用油，部分生產者便在亞麻油中添加其他劣質、低廉植物油造成亞麻油市場混亂局面出現，僅靠亞麻油性狀、形態和簡單理化指標來判斷亞麻油品質優劣有一定的局限性。

近年來，利用揮發性特征香氣成分對不同植物油進行有效判別和評價的相關研究成為熱點[3-6]。然而，僅從少數幾種特征揮發性成分的檢測是不能真正全面地判別植物油質量的優劣，也無法達到有效控制植物油品質的目的，而特征香氣指紋圖譜技術能很好的解決這個問題，它所具有的整體性與模糊性可以避免某一個或一類具體成分的檢測分析而忽略整體上控制樣品品質的弊端。目前，有關亞麻油香氣指紋圖譜構建的相關研究鮮見報道。

在對新疆亞麻油特征香氣成分分析研究基礎上，以揮發性成分種類多、含量高且香氣濃郁的YY-3號亞麻油為研究對象，采用GC-MS對新疆不同來源的炒籽亞麻油樣品進行揮發性物質分析比較，結合GC-O確認其共有揮發性物質中具有香味活性的指紋信息，構建新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜庫并進行相似度評價，同時結合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)的鑒別模型，對新疆不同來源亞麻油進行鑒別和監控，以期為新疆亞麻油品質控制、升級及品質認證提供依據。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

以新疆主產亞麻品種伊亞-3號(YY-3)為研究原料，從新疆伊犁伊寧縣、昭蘇縣、尼勒克縣、鞏留縣、新源縣、特克斯采集6個樣本(樣本編號1～6)，阿克蘇、塔城地區和奇臺縣采集3個樣本(樣本編號7～9)，共采集9個樣本，分別由新疆石河子匯昌糧油公司和新疆博樂新賽油脂股份有限公司采集提供，每個樣本采集3份，手工剔除有瑕疵、缺陷及蟲害的亞麻籽，水洗干凈并快速干制，低溫避光保存，備用。棉籽油(M)、大豆油(D)、菜籽油(C)、花生油(H)、葵花油(K)：新疆石河子農貿市場；自制摻假亞麻油樣本(亞麻油與摻假油質量比1:1)：摻菜籽油(YC)、摻棉籽油(YM)、摻大豆油(YD)；炒籽亞麻油(二級)：新疆石河子匯昌糧油公司；C6～C23正構烷烴，色譜純：上海化學試劑公司；正己烷，環己烷(沸程60～90 ℃)，分析純：上海生工生物工程有限公司；戊醛、己醛、庚醛、苯甲醛、3-甲基-2-丁烯醛，2-己酮，己醇，辛醇，丁醇，乙酸，丙酸，己酸，戊酸，丁內酯，乙酸乙酯，正十三烷烴，正十四烷，正十六烷烴，2-甲基吡嗪，2,5-二甲基吡嗪，2,3-二甲基吡嗪，環己醇，均為色譜純：美國Sigma公司。

1.2　實驗設備

SPME萃取裝置、(50/30 μm)DVB/CAR/PDMS；GC-MS氣相色譜質譜聯用儀；GC-O嗅聞系統OP275嗅聞端口；830-T1紅外線溫度計；滾筒炒籽機；家用螺桿擠壓榨油機；Alpha M.O.S-FOX 3000電子鼻系統。

1.3　炒籽亞麻油的制備

采用可控溫的家用螺桿榨油機制備。榨油前，先通過電加熱環將螺桿壓頭加熱至95 ℃。將預處理后的10 kg亞麻籽置于滾筒炒籽機中炒籽，滾筒采用電加熱(200 ℃)，炒籽過程中為防籽料受熱不均，需不停攪拌滾動，直至有亞麻油特征香氣出現，立即在預熱好的熱榨機中進行壓榨取油，然后將熱榨亞麻油離心去除沉淀，裝入25 mL棕色玻璃瓶中，充氮密封，避光低溫保存。不同品種來源亞麻油樣品均采用該方法制備，經預實驗確定最佳炒籽條件為200 ℃，40 min。

1.4　炒籽亞麻油GC-MS分析

1.4.1SPME/GC-MS分析條件

SPME條件：萃取頭使用之前按照說明書，將不同萃取頭于250 ℃的溫度下，老化100～120 min，直至無干擾雜峰出現。然后稱取10 g亞麻油樣品置于125 mL帶硅膠蓋頂空瓶中，加入1%的內標物環己醇溶液10 μL，加蓋密封后置于40 ℃恒溫水浴，采用恒溫磁力攪拌富集30 min，然后置于250 ℃的GC進樣口解吸3 min并啟用采集程序。

色譜條件：選用(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm df DB-WAX，美國SUPELCO)石英毛細柱；載氣為氦氣，流速0.8 mL/min，進樣口溫度250 ℃；程序升溫條件為：首先40 ℃保留3 min，再以6 ℃/min升到120 ℃，然后10 ℃/min升到230 ℃，保留8 min；質譜條件為離子源溫度200 ℃，電離方式EI，燈絲發射電流200 μA，電子能量70 ev，接口溫度250 ℃，掃描質量范圍為33～373 u。

1.4.2揮發性化合物定性

GC-MS實驗數據由系統自帶軟件(Xcalibur)處理完成，亞麻油樣品中揮發性組分經計算機檢索并與商業計算機譜庫NIST和WILEY比對分析，只記錄匹配度≥800的揮發性物質。在同樣色譜條件下，以C6～C23的正構烷烴混合物為標準，對其進行GC-MS分析并根據公式計算待測化合物x(待測化合物x的調整保留時間介于兩個正構烷烴之間)的保留指數(Retention Index，RI)。定性揮發性物質的保留指數可通過標準化合物進行對比確定，也可以通過質譜數據庫檢索結果或查閱文獻與之進行比較定性。保留指數(RI)計算公式如下：

式中：tRx為待測化合物x的調整保留時間；tRn為碳原子數為n的正構烷烴調整保留時間；tRn+1為碳原子數為n+1的正構烷烴調整保留時間；n為碳原子數。

1.4.3揮發性化合物的定量

本實驗中鑒定分析的揮發性物質濃度并非絕對濃度，而是相對于內標物的相對濃度，為半定量分析。計算公式如下：

1.5　炒籽亞麻油GC-O分析

SPME萃取條件、樣品預處理方法、GC條件、MS條件及定量方法同1.4.1，采用質譜和嗅聞器間的分流進樣(1:1)。經前期訓練的感官評價員通過嗅聞儀器端口進行樣品評定，并對同一亞麻油樣品至少進行兩次及以上的嗅聞評價，只有當至少兩名感官評價人員在同一時間做出相同的感官描述，對應該時間處描述詞匯才能被記錄。本次感官評定試驗選擇3分氣味強度值定義標度的時間強度法(OSME)法(1=弱；2=一般；3=強)。

1.6　香氣指紋圖譜的建立方法

1.6.1共有峰的提取

在上述實驗條件下，經GC-MS分析所得到的亞麻油中揮發性物質相對較多，因此在指紋圖譜構建過程中須選擇一個揮發性物質色譜峰作為參考峰，經GC-MS分析可知，該參考峰對應揮發性物質為己醇。通過計算不同來源亞麻油揮發性物質色譜峰的相對保留時間α和相對峰面積Sr，初步確定各共有峰作為樣品的特征指紋峰。相對峰面積計算公式和相對保留時間計算公式如下:

Sr=Sri/Srs

α=tri/trs

式中：Sri為待測峰絕對峰面積，Srs為參考峰的絕對峰面積；tri為待測峰絕對保留時間，trs為參考峰的絕對保留時間。

1.6.2方法學考察

選擇6號亞麻油樣本作為考察對象，以前期預實驗確定的己醇為參照峰，進行精密度實驗(重復進樣3次)、重復性實驗(平行樣品3份)以及穩定性實驗(每間隔8 h取樣測定，共6組)，計算不同亞麻油中各揮發性物質的相對保留時間和相對峰面積。

1.6.3相似度評價

參照中藥指紋圖譜相似度評價的方法[7]，以前期建立的新疆亞麻油樣品中揮發性香氣物質的共有模式為對照，分別采用峰重疊率、相關系數計算出各樣品與共有模式的相似度，峰重疊率計算公式如下：

1.7　數據分析

聚類分析(HCA)采用SPSS 19.0軟件處理；主成分分析(PCA)采用Unscramber 9.0軟件；偏最小二乘回歸-判別分析(PLS-DA)采用SIMCA-P 11.5軟件；使用Origin 8.5和Excel繪圖。

2　結果與討論

由前面研究可知，亞麻油整體香氣是一種多組分復雜體系，不同來源、不同工藝制備的亞麻油與個別揮發性成分有一定的相關性，但通過個別揮發性香氣成分的測定，很難有效評價不同亞麻油的來源及其真偽優劣，而亞麻油香氣特征指紋圖譜技術所具有的整體性與模糊性特點可以避免上述弊端的出現，通過待測樣品與特征指紋圖譜比對間接判別待測樣品。

GC特別適于植物油中揮發性香氣指紋圖譜的研究。阮健等[8]采用GC分析結合中藥指紋圖譜計算軟件構建了當歸揮發油的特征指紋圖譜。錢浩全等[9]也采用GC建立了高良姜揮發油的指紋圖譜，并利用其驗證發現樣品與混淆品有明顯的區別。因此，本實驗仍然采用SPME-GC/MS技術分析新疆不同產地來源亞麻油的揮發性香氣物質組成，并構建相應特征香氣指紋圖譜。

2.1　共有峰的提取

基于6號樣本中己醇的對應色譜峰的分離度和強度相對較好，且為所有亞麻油樣品所共有，因此將其作為參照峰。在此基礎上計算選擇Sr>1%的共有峰進行比較選擇，見表1和表2。

由各個亞麻油樣本的GC-MS圖可以看出(圖1)，不同來源亞麻油樣本在出峰時間上相似度較高，而各個峰含量卻存在差異。在9個亞麻油樣本中共分析鑒別出57種揮發性化合物，主要包括16種醛類、8種醇類、7種酮類、4種羧酸、5種酯類、4種烷烴、10種雜環類和3種其他揮發性物質。在以上揮發性物質中，共有46種物質均在所有亞麻油樣本中出現。由表2可知，不同來源亞麻油揮發性化合物相對峰面積大于l%的共有峰共有36個，這些峰初步可視為不同亞麻油樣本的特征香氣峰。然而，對于不同亞麻油揮發性物質而言，由于閾值不同的原因，含量相對較高的成分未必對亞麻油整體香氣有顯著貢獻作用[10-11]。因此，亞麻油特征香氣指紋圖譜構建過程需要結合GC-O分析，選擇對亞麻油整體香氣貢獻較大的揮發性物質。通過GC-O分析鑒別，在原有特征指紋圖譜的基礎上又篩選出22種亞麻油特征香氣物質作為新疆亞麻油共有的揮發性香氣物質，并建立了新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜。

2.2　新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜構建方法的驗證

特征指紋圖譜構建過程中，構建方法的精確與否，直接會影響到后續特征香氣指紋信息的準確度，因此，需要對指紋圖譜構建方法的精密度、重復性和樣品的穩定性進行考察[12-13]，見表4。

表1　共有峰相對保留時間

表1(續)

表2　共有指紋峰相對面積

表2(續)

圖1　不同亞麻油樣本相似度度分析

表3　亞麻油特征香氣指紋圖譜信息

編號名稱RI1)香味描述鑒別方式2)1己醛1078油脂味,香草味A,B,C2(E,E)-2,4-戊二烯醛1488青草味,油脂味B,C3庚醛1185炒籽味,杏仁味,堅果味A,B,C4E-2-己烯醛1206香草味,炒籽味,杏仁味B,C5辛醛1249香草味,橘子味,蜂蜜味B,C6壬醛1394杏仁味,花香味,花生味B,C7(E,E)-2,4-己二烯醛1297青草味,甜香味,谷香味C8(E,E)-2,4-庚二烯醛1488香草味,甜香味B,C92-己酮1145炒籽味A,B,C10E-3-辛烯-2-酮1298杏仁味,谷香味,蘑菇味C11(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮1458杏仁味,酸味C12己醇1351杏仁味,青草味A,B,C13辛醇1545油脂味,黃油味A,B,C14戊醇1240甜香味,香草味B,C15乙酸1422酸味,辛辣味A,B,C16丁內酯1621炒籽味,甜香味,焦糖味A,B,C17γ-己內酯2456甜香味,杏仁味C182-乙基呋喃1024炒籽味,谷香味C191-甲基吡嗪1273炒籽味,堅果味B,C202-甲基吡嗪1263堅果味,炒籽味A,B,C21三甲基吡嗪1400炒籽味,花香味B,C22α-蒎烯1056青草味,松木味B,C

注：1):采用DB-Wax分析時的RI；2)：A.與標準品一致，B.與文獻保留指數一致，C.與MS質譜數據庫一致[21-25]。

表4　指紋圖譜構建方法的精密度、重復性和穩定性研究

注：1)：揮發性化合物1-22代表GC-O-MS分析鑒別的新疆亞麻油中22種特征香氣物質。

如表4所示，該測定方法相對保留時間的精密度在0.05%～0.78%，而揮發性化合物含量的精密度在0.54%～3.19%之間；重復性實驗結果表明各個峰的保留時間的標準偏差為0.10%～0.38%，峰面積的重復率的標準偏差為1.12%～4.88%；不同間隔時間取樣測定樣品的穩定性的標準偏差(包括峰的保留時間和峰面積)也分別在0.04%～0.33%和0.89%～4.55%之間，并且亞麻油特征香氣指紋峰的相對保留時間值的標準偏差小于1.0%，相對峰面積的標準偏差均小于2.0%，說明所建立的方法用于不同亞麻油香氣特征指紋圖譜的分析具有良好的精密度和穩定性。

2.3　新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜的評價

新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜的相似度評價可以量化描述樣品的相似性，并具有指紋圖譜整體性和模糊性基本特點，既能夠體現指紋圖譜的整體相關性，又可用于不同來源亞麻油的品質評價和質量判別[14]。圖譜相似度評價方法主要包括距離系數法(基于圖譜間差異程度評價指紋圖譜相似度)、夾角余弦和相關系數法(采用圖譜之間相似性評價其相似度)及改進Nei系數法(相似性基礎上利用差異度來評價相似度)[15-20]。

先將所選定的9個不同產地的亞麻油樣本、3個市場常見摻假亞麻油樣本及其他5個植物油樣本進行GC-MS分析，并將對應揮發性物質色譜峰取其相對峰面積的均值后，建立不同來源油揮發性物質的共有模式，通過與新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜的對比分析，采用峰重疊率、相關系數計算出不同植物油樣品與共有模式的相似度，通過比較分析來說明不同樣品之間相似性和差異性。結果如圖2所示。

由圖1可以看出，除樣品7對應亞麻油的峰重疊率小于0.90外，其余新疆亞麻油共有揮發性物質的峰重疊率均大于0.90(圖2)，表明所選定的新疆亞麻油樣本所構建的新疆亞麻油特征香氣指紋信息準確可靠。通過計算相關系數發現，除樣品7以外(相關系數0.833)，所有亞麻油樣品均在0.915以上，說明所選亞麻油樣品較為穩定，各個批次亞麻油樣品在揮發性香氣物質方面與特征香氣指紋圖譜基本吻合，存在較高的相似度，這與前期GC-MS分析結果基本一致。另外，新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜還可以應用于摻假亞麻油樣品和其他植物油樣品的判別分析，由圖可以看出3個常見摻假亞麻油樣品的峰重疊率均低于0.70，只有摻入菜籽油的亞麻油(YC)相關系數接近0.80，而其他5種不同植物油樣品的相關系數和峰重疊率低于0.60。基于以上結論，利用新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜進行待測亞麻油樣品的來源及品質優劣的判別是可行的。

3　結論

3.1采用GC-MS從新疆亞麻籽油中鑒定出57種主要香氣成分，選用22個特征指紋峰(其峰面積占總峰面積的78.20%)，并結合GC-O建立了新疆亞麻籽油的香氣成分的GC-O-MS指紋圖譜；并采用夾角余弦法和相關系數法對指紋圖譜進行了分析，發現9個新疆亞麻籽油樣品具有較好的相似性。

3.2聚類分析表明，不同產地的新疆亞麻籽油樣品得到了較好的聚類。GC-O-MS指紋圖譜結合聚類分析法可為新疆亞麻籽油的產地判別提供科學參考。

3.3本研究所建立的指紋圖譜是新疆亞麻籽油所特有的，它標示了新疆亞麻籽油中這些共有香氣成分在組成比例關系等方面的共性特點。

3.4通過對摻假亞麻油樣品和其他植物油樣品的判別分析，利用新疆亞麻油特征香氣指紋圖譜進行待測亞麻油樣品的來源及品質優劣的判別是可行的。

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