丹參酮ⅡA抗乳腺癌細胞增殖的環氧合酶-2通路研究

趙俊云,楊曉敏,趙丕文

(北京中醫藥大學，北京 100029)

丹參酮ⅡA是從中藥丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)及其同屬植物中分離得到的一類脂溶性化合物，其在體內外都表現出較好的抗腫瘤活性，可抑制包括乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病、胃癌、結腸癌、前列腺癌等在內的多種腫瘤細胞株的體外增殖[1-7]。本研究旨在探討丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞系T47D、MCF-7、MDA-MB-231細胞增殖的影響，并從環氧合酶-2(COX-2)的表達及其主要轉錄因子核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)的活性探討丹參酮ⅡA抑制乳腺癌細胞增殖的分子機制。

1　實驗資料

1.1實驗材料丹參酮ⅡA購自成都曼思特生物科技有限公司；塞來昔布(Celecoxib)購自Pfizer Pharmaceuticals LLC；乳腺癌細胞系T47D、MCF-7、MDA-MB-231、5種質粒(pCOX2-Luc、pNFκB-Luc 、pAP1-Luc、pRL-CMV、EGFP質粒)均為本實驗室保存；Anti-human COX-2 antibody 購自Cell Signaling Technology；DMEM/High Glucose購自Hyclone；Fetal Bovine Serum、0.25%Trypsin-EDTA、Anti-anti、Lipofectamine 2000 Reagent均購自Invitrogen；MTT干粉購自Sigma；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega；LB液體培養基(干粉)、氨芐青霉素干粉、卡那霉素干粉均購自北京索萊寶科技有限公司；無內毒素質粒小提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2主要儀器細胞培養箱(Binder生產，型號：XMTG-908)，超凈工作臺(北京昌平長城空氣凈化工程公司生產)，倒置顯微鏡(Olympus生產，型號：CKX41)，酶標儀(Tecan生產，型號：Safire2)，高速冷凍離心機(Eppendorf生產，型號：3K15)，熒光顯微鏡(Nikon生產，型號：TE2000)，發光檢測儀(Promega生產，型號：Glomax Multi Detection System)。

1.3實驗方法

1.3.1MTT實驗常規培養T47D、MCF-7、MDA-MB-231，使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶工作液消化細胞，制備細胞懸液，于96孔細胞培養板中每孔接種200 μL細胞懸液，每孔約含4×104個細胞，培養24 h。除對照組外，丹參酮ⅡA 1～5組分別加入丹參酮ⅡA至終濃度為10-6mol/L、5×10-6mol/L、10-5mol/L、5×10-5mol/L 、10-4mol/L，每組設5復孔。分別于培養24 h、48 h、72 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT，孵育4～6 h后，每孔吸棄上清液100 μL，每孔加入150 μL DMSO，避光混勻15 min，酶標儀檢測OD570，計算抑制率。

1.3.2Westernblot檢測常規培養T47D、MCF-7、MDA-MB-231，使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶工作液消化細胞，制備細胞懸液，于6孔細胞培養板中每孔接種2 mL細胞懸液，每孔約含5×105個細胞，培養24 h。除對照組外，丹參酮ⅡA組分別加入丹參酮ⅡA至終濃度為5×10-5mol/L；于培養48 h后裂解細胞，提取總蛋白，定量后進行SDS-PAGE電泳，使用PVDF膜進行轉移電泳，封閉后，加入稀釋后的Anti-human COX-2 antibody孵育過夜，二抗孵育1 h后曝光顯影。

1.3.3脂質體轉染實驗按照常規方法擴增質粒，pCOX2-Luc、pNFκB-Luc、pAP1-Luc、pRL-CMV使用含0.1 mg/mL氨芐青霉素的LB培養液，EGFP質粒使用含0.05 mg/mL卡那霉素的LB培養液。搖床培養菌液24 h后，按照無內毒素質粒小提試劑盒說明抽提質粒，使用紫外分光光度計測定各種質粒的純度及濃度，-20 ℃保存備用。于96孔板中每孔接種200 μL細胞懸液，每孔約含8×104個細胞，培養24 h后，細胞密度達90%左右時進行轉染。將EGFP質粒與適量轉染試劑用無血清無抗生素DMEM混勻，室溫孵育20 min后，按比例加入96孔板中，并設5孔未經轉染的細胞作為對照組。培養36 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，估計細胞的轉染效率。于48孔板中每孔接種250 μL細胞懸液，每孔約含2×105個細胞，培養24 h后，細胞密度達90%左右時進行轉染。將pCOX2-Luc與pRL-CMV分別按10∶1，100∶1，1 000∶1比例混合，再用無血清無抗生素DMEM與適量轉染試劑混勻，室溫孵育20 min后，按比例加入48孔板中，并設5孔未經轉染的細胞作為對照。同樣方法進行pNFκB-Luc與pRL-CMV、pAP1-Luc與pRL-CMV雙轉染。

1.3.4雙熒光素酶報告基因檢測培養48 h后，按Dual-Luciferase Reporter Assay System說明處理細胞，在發光檢測儀上分別讀取螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性數值，計算比值。選取適當的質粒比例，再次進行細胞的雙質粒轉染，同時加入一定量的丹參酮ⅡA處理，培養48 h后，在發光檢測儀上讀取熒光素酶活性數值，計算比值。

2　結　　果

2.1丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞體外增殖的影響MTT實驗結果顯示，丹參酮ⅡA對T47D、MCF-7、MDA-MB-231的體外增殖有抑制作用，且抑制率與丹參酮ⅡA的濃度及作用時長呈正相關。見表1～3。綜合考慮藥效及細胞存活數量，選取抑制率接近50%的5×10-5mol/L作用48 h作為后續實驗中丹參酮ⅡA的濃度與作用時長。

表1　丹參酮ⅡA對T47D增殖的影響

表2　丹參酮ⅡA對MCF-7增殖的影響

表3　丹參酮ⅡA對MDA-MB-231增殖的影響

2.2丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞COX-2蛋白水平的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理3種乳腺癌細胞48 h后，與對照組相比，3種細胞中COX-2的蛋白水平均明顯降低。見圖1。

圖1　3種乳腺癌細胞中COX-2蛋白表達水平

2.3丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞COX-2轉錄活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉染(pCOX2-Luc∶pRL-CMV=100∶1)后的3種乳腺癌細胞48 h后，與對照組相比，T47D和MCF-7細胞丹參酮ⅡA組的比值顯著降低(P均<0.05)。見表4。

表4　丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞COX-2轉錄活性的影響

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.4丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞NF-κB活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉染(pNFκB-Luc∶pRL-CMV=1 000∶1)后的3種乳腺癌細胞48 h后，與對照組相比，T47D和MCF-7細胞丹參酮ⅡA組的比值顯著降低(P均<0.05)。見表5。

表5　丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞NF-κB活性的影響

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.5丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞AP-1活性的影響使用終濃度為5×10-5mol/L的丹參酮ⅡA處理轉染(pAP1-Luc∶pRL-CMV=1 000∶1)后的3種乳腺癌細胞48 h后，與對照組相比，3種細胞丹參酮ⅡA組的比值均顯著降低(P均<0.05)。見表6。

表6　丹參酮ⅡA對乳腺癌細胞AP-1活性的影響

注：①與對照組比較，P<0.05。

3　討　　論

丹參酮ⅡA是一種被證實具有抗腫瘤活性的中藥小分子單體化合物，可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移等多途徑發揮抗腫瘤作用，其與某些化療藥物合用有減毒增效的作用[1-7]。本研究使用了3種乳腺癌細胞系，其中T47D和MCF-7是雌激素受體陽性細胞系，MDA-MB-231是三陰性細胞系，這3種乳腺癌細胞均有COX-2高表達的特性。丹參酮ⅡA等中藥單體對乳腺癌細胞系的抑制作用與雌激素受體陽性與否并無明顯關系。因此本文著重探討丹參酮ⅡA對與腫瘤密切相關的炎癥通路COX-2的抑制作用，進一步闡明丹參酮ⅡA的抗腫瘤機制。

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌的預防、早期發現及治療可有效降低群體發病率和提高患者生存質量。目前乳腺癌的治療手段主要有手術治療、放化療、生物治療等，對乳腺癌進行早期篩查診斷，并輔以抗腫瘤天然藥物干預，可有效改善患者的生存質量。本研究結果顯示丹參酮ⅡA可有效抑制乳腺癌細胞的體外增殖，且呈明顯的量效關系和時間依賴性，其中終濃度5×10-6mol/L的丹參酮ⅡA處理乳腺癌細胞48 h后能達到近50%的抑制率，較低的濃度及其適當的起效時間顯示了丹參酮ⅡA在腫瘤治療中的應用前景。COX-2是COX家族的重要成員。COX主要有3種同工酶，其中COX-1是一種持續表達的結構酶，發揮看家作用，主要調節生理性前列腺素合成[8]；COX-3是一種新型剪接異構體，與COX-1源于同一基因，主要在心、腦組織持續表達[9]；COX-2又稱誘導型環氧化酶，在正常生理狀態下多數組織不表達或低表達，但在生長因子、內毒素及腫瘤促進因子的作用下呈誘導性表達，尤其是在腫瘤組織中，COX-2的表達普遍有增強趨勢[8]。除此之外，COX-2還是重要的細胞凋亡抑制因子，與腫瘤細胞的命運密切相關。大量研究表明，COX-2可通過促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤血管形成以及增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，從而促進腫瘤的形成與發展[10-12]。相關臨床資料也表明，COX-2 與腫癌的發生、發展及轉移關系密切, 對于腫瘤的早期診斷及預后預測有重要意義, 是多種腫瘤治療藥物的重要靶點之一[13]。COX-2抑制劑目前已廣泛應用于腫瘤的臨床治療。本研究發現，丹參酮ⅡA可顯著降低乳腺癌細胞COX-2的蛋白水平，且在啟動子水平有效抑制COX-2的轉錄，這顯示了丹參酮ⅡA在抑制乳腺癌發展、轉移以及預防中的應用前景。與T47D、MCF-7不同，MDA-MB-231在COX-2轉錄水平上的降低不顯著，提示雌激素受體存在與否與丹參酮ⅡA對COX-2轉錄水平的影響有相關性。

COX-2基因的啟動子序列上游除1個保守的啟動子序列TATA盒以外，還包含一些早期應答相關的順式作用元件，如轉錄因子NF-κB、AP-1的結合位點[8]。NF-κB可調控參與免疫反應早期和炎癥反應各階段的許多分子的調控，包括COX-2。AP-1是炎癥、腫瘤等情況下調節COX-2表達的重要轉錄因子，主要以磷酸化c-jun/c-fos二聚體形式與AP-1位點結合進而增強COX-2的轉錄水平[14]。本研究中使用位點質粒pAP1-Luc和pNFκB-Luc，可以直觀顯示發揮轉錄增強作用的NF-κB、AP-1位點的活性。實驗結果顯示丹參酮ⅡA可有效降低乳腺癌細胞中該位點的活性。值得注意的是，丹參酮ⅡA主要對AP-1位點的活性有顯著降低，對于MDA-MB-231中NF-κB位點的活性無明顯改變，結合上述結果，可以推測丹參酮ⅡA作用于MDA-MB-231的機制不同于T47D、MCF-7，這是否與雌激素受體有無相關還有待驗證。對于轉錄因子NF-κB、AP-1對乳腺癌細胞增殖的影響及丹參酮ⅡA對其的干預，還將在后續工作中進一步探討。

[參考文獻]

[1]Zhao PW,Niu JZ,Wang JF,et al. Research on the inhibitory effect tanshinone ⅡA on breast cancer cell proliferation[J]. Chin Pharmacol Bull, 2010, 26(7):903-906

[2]Dai ZK,Shi JS,Wu Q,et al. Apoptosis inducing effect of Tanshinone ⅡA on human lung adenocarcinoma A549 cells[J]. Chin Pharmacol Bull,2010,26(11):1505-1508

[3]Cheng CY,Su CC. Tanshinone ⅡA inhibits Hep-J5 cells by increasing calreticulin,caspase 12 and GADD153 protein expression[J]. Int J Mol Med,2010,26(3):379-385

[4]Liu C,Li J,Wang L,et al. Analysis of tanshinone ⅡA induced cellular apoptosis in leukemia cells by genome-wide expression profiling[J]. BMC Complement Altern Med,2012,12(1):5

[5]Chen J,Shi DY,Liu SL,et al. Tanshinone ⅡA induces growth inhibition and apoptosis in gastric cancer in vitro and in vivo[J]. Oncol Rep,2012,27(2):523-528

[6]Zhou LH,Hu Q,Sui H,et al. Tanshinone Ⅱ-a inhibits angiogenesis through down regulation of COX-2 in human colorectal cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(9):4453-4458

[7]Won SH,Lee HJ,Jeong SJ,et al. Tanshinone ⅡA induces mitochondria dependent apoptosis in prostate cancer cells in association with an inhibition of phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway[J]. Biol Pharm Bull,2010,33(11):1828-1834

[8]Mauro A,Lipari L,Leone A,et al. Expression of cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 in normal and pathological human oral mucosa[J]. Folia Histochem Cytobiol,2010,48(4):555-563

[9]Chandrasekharan NV,Dai H,Roos KL,et al. COX-3,a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs:cloning, structure,and expression[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(21):13926-13931

[10] Arun B,Goss P. The role of COX-2 inhibition in breast cancer treatment and prevention[J]. Semin Oncol,2004,31(Suppl7):22-29

[11] Edwards J,Mukherjee R,Munro AF,et al. HER2 and COX2 expression in human prostate cancer[J]. Eur J Cancer,2004,40(1):50-55

[12] Berasain C,Castillo J,Perugorria MJ,et al. Inflammation and liver cancer:new molecular links[J]. Ann N Y Acad Sci,2009,1155(1):206-221

[13] Singh B,Cook KR,Vincent L,et al. Role of COX-2 in tumorospheres derived from a breast cancer cell line[J]. J Surg Res,2011,168(1):39-49

[14] Caputto BL,Cardozo Gizzi AM,Gil GA. c-Fos:an AP-1 transcription factor with an additional cytoplasmic,non-genomic lipid synthesis activation capacity[J]. Biochim Biophys Acta,2014,1841(9):1241-1246