黃芪多糖對人子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤Wnt基因轉導通路的影響

邱艷麗，丁　妍， 陳德森

(1. 湖北省十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬醫院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000)

子宮內膜癌(EC)是婦科三大惡性腫瘤之一，占婦科惡性腫瘤的70%以上，病死率僅次于卵巢癌，其發病率呈持續增高趨勢，嚴重威脅著女性的生命健康[1-2]。Wnt基因轉導通路中相關因子β-連環蛋白(β-catenin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及其基因表達與子宮內膜癌的發生密切相關，Wnt通路能通過β-catenin或E-cadherin蛋白與胞膜受體特異性結合而引發一連串級聯反應，最終引起細胞核內基因表達改變，Wnt通路異常調控與子宮內膜癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發生有重要相關性[3-4]。目前抗腫瘤的中醫藥研究熱點較多，如黃芪、當歸等。黃芪多糖是中藥黃芪的主要有效成分，具有抗腫瘤的藥理作用[5]，但其在抗子宮內膜癌方面鮮有研究。本研究通過觀察黃芪多糖對人子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤Wnt基因轉導通路中相關因子β-catenin和E-cadherin表達的影響，探討了黃芪多糖抗子宮內膜癌的作用及可能機制，旨在為其臨床應用提供一定的理論依據。

1　實驗資料

1.1實驗動物SPF級雌性BALB/c品系裸小鼠30只，鼠齡4～5周，體質量(17.5±2.5)g，購自湖北醫藥學院實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2016-0008。采用隨機數字表編號后隨機分為對照組、模型組、黃芪多糖組，每組10只。

1.2藥物和試劑黃芪多糖注射液(北京維德爾生物科技有限公司)，按小鼠體表面積換算黃芪多糖注射液用量為0.2 mL/(kg·d)；胎牛血清和DMEM培養基(GIBCO公司)；β-catenin和E-cadherin兩步法免疫組化檢測試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)；β-catenin和E-cadherin引物(南京建成生物工程研究所)；人子宮內膜癌細胞系Ishikawa腫瘤細胞(十堰市太和醫院生物科學研究所提供)。

1.3人子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤模型建立及干預先將人子宮內膜癌細胞系Ishikawa腫瘤細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于5% CO2、37 ℃孵育箱培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。待Ishikawa腫瘤細胞呈對數生長期時，可觀察到Ishikawa腫瘤細胞沿培養瓶底生長，當生長達培養瓶底75%～85%時，棄掉培養液，用PBS沖洗2次，再用0.25%胰蛋白酶消化，收集腫瘤細胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS重懸腫瘤細胞，然后制成 5×105mL-1Ishikawa細胞懸液備用。接種時在無菌條件下抽取Ishikawa瘤細胞懸液，按0.2 mL/鼠的劑量皮下注射于裸鼠右側肩胛背部。接種后繼續在SPF級層流室內飼養，每天觀察其右側肩胛背部是否有腫瘤生長，以接種部位出現腫瘤小結節或觸及有小結節為成瘤標準，一般4周后即可成瘤，如第1次接種失敗，可酌情再次接種Ishikawa瘤細胞直到成瘤[6]。本實驗4周后所有造模裸小鼠均成瘤。 成瘤后，黃芪多糖組給予黃芪多糖注射液0.2 mL/(kg·d)肌肉注射，對照組、模型組肌肉注射等量生理鹽水，均連續14 d。

1.4檢測指標和方法

1.4.1移植瘤抑瘤率檢測實驗結束后處死所有大鼠，摘取瘤體，分離包膜，稱質量，用游標卡尺準確測量瘤體長、短徑各3次，取其均值計算瘤體積。瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑/2。抑瘤率= (模型組平均瘤質量-黃芪多糖組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%。

1.4.2β-catenin和E-cadherin蛋白表達檢測取瘤組織(對照組取子宮內膜組織)，采用二步法行免疫細胞化學染色檢測β-catenin和E-cadherin蛋白表達情況。E-cadherin和β-catenin陽性判定：細胞膜或細胞質棕黃色。在高倍視野下，每張切片均隨機選取6個視野進行結果判定。記分采用3個參數的半定量分析：即陽性細胞數、染色強度及兩者記分的乘積。判定標準：棕褐色3分，棕黃色2分，淡黃色1分，無著色0分；陽性細胞數量分級和記分標準：1個視野內陽性著色細胞>75%為4分，>50%～75%為3分，>10%～50%計 2分，1%～10%計1分；無陽性細胞為陰性，計0分。將染色強度和陽性細胞數量兩項積分相加，結果判定：0～3分為陰性，4～7分為陽性[7]。

1.4.3β-catenin和E-cadherin mRNA表達檢測采用半定量RT-PCR檢測。取瘤體組織(對照組取子宮組織)約50 mg，勻漿，采用Trizol法提取組織中的總RNA，取1 μg 總RNA，用AMV逆轉錄酶逆轉錄，逆轉錄產物PCR擴增，以GAPDH為內參， PCR擴增用 pfimer5 軟件設計引物。PCR反應條件：95 ℃ 2 min 變性，95 ℃、52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增40個循環。以目的基因灰度值/GAPDH灰度值之比值表示β-catenin和E-cadherin mRNA的相對值[8]。β-catenin上游引物序列為5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3，下游引物序列為5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3，擴增產物長度為201 kDa；E-cadherin上游引物序列為5’-CCATGTCCAAAAGTGGTGTAAT-3，下游引物序列為5’-ATGGATGCATTGAGTGAAGTA-3，擴增產物長度為134 kDa；GAPDH上游引物序列為5’-GGAGAAACCTGCCAAGTATGAT-3，下游引物序列為5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCG-3，擴增產物長度為125 kDa。

2　結　　果

2.1各組瘤質量、瘤體積及抑瘤率比較對照組無腫瘤形成；黃芪多糖組瘤質量、瘤體積均明顯低于模型組(P均<0.05)，抑瘤率明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1　模型組和黃芪多糖組瘤質量、瘤體積及抑瘤率比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

2.2各組β-catenin和E-cadherin蛋白及mRNA表達情況對照組子宮組織中僅有少量β-catenin陽性表達，E-cadherin高表達。模型組瘤組織中β-catenin蛋白和β-catenin mRNA表達水平均明顯高于對照組(P均 <0.05)，而黃芪多糖組均明顯低于模型組(P均<0.05)；模型組瘤組織中E-cadherin蛋白和E-cadherin mRNA表達水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，而黃芪多糖組均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組β-catenin和E-cadherin蛋白及mRNA表達情況

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3　討　　論

子宮內膜癌早期發現后可采用手術和輔助放化療治療，但大多數患者臨床確診時已到中晚期，單純采用西醫治療難以獲得理想的療效。中醫藥在延緩病情進展、提高患者生存質量等方面有其獨特優勢，故更多患者在手術和輔助放化后或治療無望時求助于中醫治療[3]。中草藥黃芪富含多種微量元素，如皂苷、葉酸、黃芪多糖、氨基酸等，其中黃芪多糖具有抗菌、抗炎、抗氧化、利尿、護肝、抗應激等作用[9-10]，可增強自然殺傷細胞、巨噬細胞、B 淋巴細胞等的活性，并通過促進免疫因子釋放強化機體免疫功能，促進細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖而產生抑癌抗癌作用[11-12]。目前對黃芪的研究比較深入，臨床應用也比較廣泛，但黃芪多糖的抗腫瘤作用機制比較復雜，為此筆者進行了相關研究。

Wnt信號通路在胚胎的發育過程及多種腫瘤的發生發展中起重要的啟動作用—Wnt通路被異常激活，而β-catenin是Wnt通路異常激活的關鍵因子。β-catenin作為癌基因，其與子宮內膜癌、乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發生、發展及侵襲轉移等密切相關[13]。Wnt信號通路分經典型和非經典型途徑，經典Wnt信號通路蛋白與膜受體卷曲蛋白結合，通過β-catenin核易位來激活靶基因的轉錄活性，故經典Wnt信號通路與腫瘤發生發展密切相關[14]。研究表明，β-catenin如不能被糖原合成酶激酶3β磷酸化，可導致β-catenin不能被胞內泛素識別，不能被蛋白酶復合體降解，這造成的后果是β-catenin大量游離聚集于胞質中，當β-catenin進入胞核與核內轉錄因子T細胞因子/淋巴細胞增強因子等結合后會刺激一系列靶基因表達，包括發育控制基因、腫瘤發生相關基因和細胞增殖調控基因，引起細胞增殖異常并最終導致細胞癌變[15]。E-cadherin蛋白是鈣依賴性黏附蛋白，廣泛分布于上皮細胞膜黏附區，故正常上皮組織中E-cadherin蛋白陽性表達，其介導同嗜性細胞黏附及細胞與細胞間的粘連，與β-catenin介導細胞與基質連接，共同調控腫瘤細胞的侵襲及轉移[16]。E-cadherin 蛋白在腫瘤組織中低表達或不表達，E-cadherin缺失或低表達可導致同型細胞或腫瘤細胞間的結構及功能異常，使介導細胞的黏附功能降低或喪失而造成細胞無限制增生，導致腫瘤浸潤和擴散甚至轉移[17-18]。因此，研究黃芪多糖對Wnt通路相關因子β-catenin和E-cadherin蛋白及基因調控的影響具有重要意義。

在本實驗中，免疫組化染色發現，黃芪多糖組E-cadherin蛋白表達增強、β-catenin表達減弱，RT-PCR結果顯示黃芪多糖組E-cadherin mRNA表達增強、β-catenin mRNA表達減弱，提示黃芪多糖是通過干預Wnt通路相關因子β-catenin和E-cadherin蛋白及基因調控達到抗癌作用的。在腫瘤分化增殖過程中，E-cadherin蛋白在正常子宮內膜組織中高表達，說明E-cadherin蛋白對維持子宮內膜上皮完整性具有重要意義，當E-cadherin蛋白表達陽性率降低時，細胞間的黏附功能降低，腫瘤細胞間會喪失接觸性抑制，使其更容易分離、增生、增殖、脫落和擴散。黃芪多糖可能作用于這一環節，通過提高E-cadherin蛋白及其基因表達，提高細胞間的黏附功能，使細胞分化增殖趨于正常，達到抑癌的目的。另一方面，黃芪多糖還可能通過抑制β-catenin蛋白，通過抑制Wnt基因轉導通路而發揮抗腫瘤作用。歐陽小明等[19]研究發現，黃芪多糖可通過作用于β-catenin和E-cadherin等抑制Wnt基因轉導通路的異常激活而起到抗腫瘤作用。細胞結構和功能的完整性依賴E-cadherin和β-catenin形成E-cadherin/β-catenin 復合體來維持，在子宮內膜癌的發生及惡化過程中，E-cadherin表達降低會導致β-catenin從 E-cadherin/catenin 復合體中游離出來，Wnt 通路異常激活，β-catenin在胞漿中大量集聚并進入到細胞核，導致腫瘤細胞轉移與惡化[20]。在本研究中，黃芪多糖組β-catenin蛋白及其基因表達減弱，這可能是黃芪多糖通過提高E-cadherin蛋白及其基因表達來提高細胞間的黏附功能，并通過抑制β-catenin在胞漿中集聚，避免Wnt通路被異常激活而達到抗癌作用。另外黃芪多糖組瘤體積和瘤質量均低于模型組，提示黃芪多糖具有抑制腫瘤生長的作用。

總之，黃芪多糖可促進E-cadherin蛋白和基因表達，抑制β-catenin蛋白和基因表達，通過調控Wnt基因轉導通路而發揮抗腫瘤作用。但黃芪抗腫瘤作用機制復雜，關于其防治子宮內膜癌的其他作用機制還需進一步研究，以提高其臨床應用范圍。

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