噻吩取代長鏈查爾酮對腫瘤侵襲的抑制作用

趙松峰，張　珩，魏　涵，劉芝梅，張曉堅，劉子維

(1. 鄭州大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州　450052；2. 武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢　430205；3. 人福醫藥集團光谷生物城園區科福新藥公司，湖北 武漢　430074)

查爾酮是廣泛存在于自然界中一種黃酮類化合物，具有多種生物活性[1]。相對于黃酮的A/B環之間的吡喃酮的連接方式，查爾酮的A/B環之間以丙烯酮連接，在分子結構上具有較大的柔性，因此，能與不同的受體結合，具有廣泛靶點效應[2]。而多靶點的化合物容易產生過于廣泛的效應[3]，查爾酮作為一個最小能級構型為長鏈結構的化合物，3個結構單元為2個苯環和1個丙烯酮。增加1個分子單元，使得藥物分子的分子鏈長度變為原來的4/3，增加了化合物所占有的空間位置，從而增強其特異性。同時引入官能團能夠加強其對于特定靶點的作用力。

本研究的先導化合物TSAHC(Fig 1)為近羰基端的磺酰胺化的長鏈查耳酮，被報道具有抑制腫瘤細胞侵襲的能力[4]，是通過抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)-2/9蛋白發揮作用[5]。本文以噻吩基團為主要的近羰基端衍生結構，通過Claisen-Schmidt縮合得到6個新的長鏈類查耳酮化合物。通過抗腫瘤細胞增殖實驗確定作用濃度，采用Transwell實驗評估其抗腫瘤遷移的能力，同時評估其對MMP-2蛋白的表達情況[6]。最后，通過SYBYL-X1.2進行基于受體模式的分子對接預測。

細胞外基質(extracellular matrix, ECM)是一種維持細胞正常形態，保持細胞間正常接觸的重要物質，廣泛分布于細胞中。相互交錯并形成水樣的膠狀物[7]。腫瘤細胞從原發部位脫落，侵入ECM，分泌各種降解酶類，破壞ECM并進入血管，并滲到其他部位，形成轉移灶。一般認為，轉移度高的腫瘤細胞與其破壞ECM的能力密切相關[8]。多種酶被證實參與了侵襲的行為，而MMPs與ECM的降解被認為是腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵因素，在多種惡性腫瘤均可見MMPs表達水平的增高[9]。本研究基于先導化合物和抗腫瘤侵襲靶點MMP-2而進行，結合分子藥理學與計算機輔助設計，共同探究所得化合物的作用機制與構效關系。

1　材料與方法

1.1化合物合成

1.1.1儀器與試劑由linux平臺支撐的SYBYL-X1.2軟件工作站；予華YRE-301型旋轉蒸發儀；予華X-5型顯微熔點測定儀；AVANCE III HD 400 MHz超導核磁共振譜儀 (Bruker公司)；LCMS-2010液質聯用(Shimadzu公司)。氘代溶劑為DMSO-D6，CDCl3或MeOD，內標為TMS。TSAHC由人福醫藥集團-科福新藥公司合成并提供，HPLC-DAD檢測純度>98%。起始化合物如無特別描述，均購自阿拉丁試劑。有機溶劑均為國藥試劑分析純或化學純。

Fig 1　Chemical reaction process and structure of TSAHC

1.1.2合成路線首先采用酰化反應和酯化反應，得到3個中間產物，然后將3個中間產物分別與鄰羥基苯甲醛和對甲氧基苯甲醛進行羥醛縮合反應，得到了6個新的近羰基端延長的查耳酮類化合物，并進行表征。反應過程見Fig 1。

1.1.3酰胺和磺酰胺苯乙酮的合成取10 mmol的2-噻吩甲酸/2-噻吩磺酸與50 mmol的二氯亞砜混合置于圓底燒瓶中持續攪拌，室溫反應過夜后，蒸掉多余的二氯亞砜，得到具有反應活性的酰氯。向其中加入二氯甲烷溶解。而后將其滴加入含有10 mmol的4-氨基苯乙酮二氯甲烷溶液和5 mmol吡啶的混合溶液的圓底燒瓶中，冰浴反應2 h，旋干多余溶劑，飽和NaHCO3溶液洗滌殘留物，最后用乙酸乙酯萃取飽和NaHCO3層3次，回收乙酸乙酯得到目標苯乙酮。

1.1.4查爾酮的合成將三氟化硼乙醚溶液滴入含有1 mmol苯乙酮和1 mmol苯甲醛和10 mL二氧六環的圓底燒瓶中。80℃反應14～24 h，旋干二氧六環，而后用乙酸乙酯萃取殘留物，然后依次用10% HCl溶液、蒸餾水、鹽水洗滌萃取液，再用無水Na2SO4干燥，真空濃縮，殘渣進行柱層析(正己烷 ∶乙酸乙酯=3 ∶1～1 ∶1)純化，最后得到產物為黃色固體。

1.2抗腫瘤侵襲活性評估

1.2.1細胞培養材料二甲基亞砜 (DMSO)、噻唑藍 (MTT)為Sigma公司產品；人源乳腺癌細胞(MDA-MB-231)由鄭州大學第一附屬醫院提供；胰蛋白酶：美國Gibco公司；新生小牛血清：杭州四季青公司；DMEM培養基：奧浦邁公司；Transwell小室：美國Costar公司；Matrigel膠：美國BD公司。

1.2.2細胞培養人源乳腺癌細胞(MDA-MB-231)培養于添加了10%胎牛血清以及100 kU·L-1青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中；培養條件為37℃、5% CO2，每隔2～3 d傳代1次，使細胞數目保持在1×108·L-1～1×109·L-1左右，生長代數在30代以前，且臺盼藍檢測存活率大于95%的細胞方可用于實驗。

1.2.3抗腫瘤細胞增殖實驗待MDA-MB-231細胞長至70%～80%融合度時，將其接種至96孔板內，接種密度為5×107·L-1，培養12 h，以不同濃度 (0.05、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol·L-1) 的6種查耳酮化合物與TSAHC對照品，分別作用于MDA-MB-231細胞24 h。采用MTT細胞增殖檢測法測定供試化合物對腫瘤細胞株的抑制作用。用酶標儀檢測，檢測波長570 nm。以0.1% DMSO為空白對照。存活率=(加藥組OD值/對照組OD值)×100%，實驗重復3次。

1.2.4抗腫瘤細胞侵襲實驗Transwell法評價所制備查耳酮化合物對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響。當MDA-MB-231細胞長至70%～80% 融合度時，取上述實驗中所得的IC50值為培養濃度，共培養24 h。取200 μL不同劑量組細胞移至裝有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜，直徑為13 mm的Transwell小室上室 (含2% FBS，1×105/室)，上室預鋪制20 μL Matrigel膠，下室加入含10% FBS的DMEM高糖培養基，作用12 h后結晶紫染色，并對每組取3個不同的視野拍照。

1.2.5MMP-2蛋白表達的檢測將化合物1～6與陽性對照TSAHC，同0.1 % DMSO的空白對照組與細胞共培養后，胰酶消化，用預冷至4℃的裂解緩沖液加入到經PBS漂洗的培養細胞中，冰上一段時間后離心，上清液保存于-20℃。采用Bradford法測定蛋白質濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳分離。通過電轉移法將蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移至硝酸纖維素膜，后者在含5%脫脂奶粉的TTBS中37℃封閉，加入MMP-2一抗 (Santa Cruz, CA) 4℃孵育過夜，TTBS充分漂洗，加入二抗37℃作用，TTBS充分漂洗，ECL顯色分析結果。

1.3分子對接實驗首先采用分子力學程序，對待測目標化合物1～6進行能量優化，加載Gasteiger-MMFF94 電荷，以Powell能量梯度法優化得各個分子的低能穩定構象，保存入數據庫。而后根據文獻，從 Protein Data Bank 中選取MMP-2蛋白模型，加氫去水，修復殘基等操作確立適合對接的蛋白凹陷或殘基。采用SYBYL-X1.2軟件的DOCKING模塊，以Surflex-Dock GeomX 模式進行對接，并同時計算出LogP值。

2　結果

2.1NMR譜圖分析(以活性最高的化合物2.3為例)從Fig 2A,2B共有的信號中，可以看出查耳酮化合物所特有高耦合常數的雙鍵dd峰，和噻吩環上的氫數目為1的兩個d峰和一個t峰。Fig 2A采用MeDO作為氘代溶劑，可以從圖中分辨出兩個苯環上的氫原子，其中一個苯環上具有典型的氫數目為4的dd峰，原子個數符合結構式。但是由于MeDO的離子交換作用，在譜上找不到酰胺和間位羥基的氫信號。Fig 2B采用DMSO作為氘代溶劑，也可以從圖中分辨出兩個苯環上的氫原子，原子個數符合結構式，其中在8.2左右可以明顯看出苯環上的dd峰，并可在低場找到兩個數目為1的氫信號，分別為磺酰胺和間位羥基的氫信號，化合物結構的詳細信息如下：

化合物1淡黃色固體，產率31%，熔點: (209～212)℃ 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.63 (s, 1H), 8.26 (d, J=8.7 Hz, 2H), 8.10 (dd, J=23.1, 4.4 Hz, 3H), 7.88 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.67 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.32 (d, J=20.1 Hz, 2H), 7.30～7.19 (m, 2H), 6.88 (d, J=7.9 Hz, 1H)。MS(ES, m/z): 348.8 (ES-)。

化合物2淡黃色固體，產率36%，熔點: 209～162℃ 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.01 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.74 (d, J=5.0 Hz, 1H), 7.65 (t, J=5.9 Hz, 3H), 7.34 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.28～7.17 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 7.10～7.05 (m, 1H), 6.87 (d, J=9.0 Hz, 1H). MS(ES, m/z): 347.8 (ES-)。

化合物3淡黃色固體，產率32%，熔點: (159～162)℃ 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.55 (s, 1H), 9.63 (s, 1H), 8.20 (d, J=8.6 Hz, 2H), 8.10 (d, J=3.5 Hz, 2H), 8.02～7.79 (m, 4H), 7.64 (d, J=15.7 Hz, 1H), 7.29 (dd, J=20.5, 6.2 Hz, 3H), 6.88 (d, J=7.7 Hz, 1H). MS(ES, m/z): 383.8 (ES-)。

化合物4淡黃色固體，產率28%，熔點: (159～162) ℃ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.99 (d, J=

Fig 2　NMR of compound 2(A) and 3(B)

8.5 Hz, 2H), 7.81 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.61(dd, J=11.2, 4.4 Hz, 4H), 7.39 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.29 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.07～7.01 (m, 1H), 6.96 (d, J=8.6 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H)。MS(ES, m/z): 362.1 (ES-)。

化合物5淡黃色固體，產率29%，熔點: (159～162) ℃ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.97 (s, 1H), 7.86～7.78 (m, 3H), 7.71 (d, J=3.5 Hz, 1H), 7.62 (t, J=6.3 Hz, 3H), 7.46 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.20～7.14 (m, 1H), 6.96 (d, J=8.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H)。MS(ES, m/z): 361.9 (ES-)。

化合物6淡黃色固體，產率35%，熔點: (159～162) ℃ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (d, J=15.8 Hz, 2H), 8.01 (d, J=3.7 Hz, 1H), 7.81 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.70 (d, J=4.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.39 (t, J=11.8 Hz, 3H), 7.23～7.15 (m, 1H), 6.95 (d, J=8.7 Hz, 2H), 3.86 (s,3H)。MS(ES, m/z): 397.8 (ES-)。

2.2抗腫瘤細胞增殖和侵襲結果

2.2.1抗腫瘤細胞增殖采用MTT比色法評估所得化合物對于MDA-MB-231存活率的影響。化合物1～6與陽性對照TSAHC對于MDA-MB-231的IC50依次為18.53、6.32、4.72>20>20、5.89、1.98 μmol·L-1。其中化合物2、3、6與陽性對照表現較好，該結果為后續實驗提供了給藥濃度。

2.2.2抗腫瘤細胞侵襲如Fig 3所示，相較于空白對照組 (0.1% DMSO)，以IC50為作用濃度，化合物2、3與TSAHC表現出了良好的抑制腫瘤侵襲的能力，這與抗增殖實驗中的趨勢十分吻合。其他化合物則沒有顯示出太多區別，尤其是化合物6，雖然可以有效抑制腫瘤細胞的增殖，但對腫瘤細胞的侵襲行為并沒有影響。鑒于Matrigel被用作ECM的模擬物，因此，可以推斷化合物2、3可以抑制腫瘤細胞MDA-MB-231對ECM的降解，而化合物6卻沒有這種能力。該結論為下一步的實驗指明了方向。

2.2.3MMP-2蛋白表達水平分析如Fig 4所示，化合物2、3可以有效抑制MMP-2蛋白的表達，MMP-2的表達水平與表觀學實驗中所得結論基本一致。

2.3分子對接結果分析以MMP-2為靶蛋白，對化合物1～6進行分子對接。結果顯示，化合物2、3與MMP-2蛋白模型有著良好的作用，對接得分見Tab 1，化合物2、3的3D-QSAR見Fig 5。

Tab 1　Molecular docking scores and Log P of six compounds

Fig 3　Inhibition of tumor invasion by Transwell assay in MDA-MB-231(n=3)

A～F: Groups treated by compounds 1～6; G,7: TSAHC; H,8: Blank group; I: Bar graph for the group A～H.*P<0.05vsblank group

3　討論

腫瘤細胞隨血液流動離開原發灶，分泌蛋白酶，侵蝕基底膜，并發生隨血流的遷徙行為是腫瘤發生重要環節。本實驗中我們采用的是膜孔徑為8 μm的Transwell小室來評價所得查耳酮對于對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響。腫瘤細胞在上層的饑餓條件以及下層的血清誘導的情況下，穿過碳酸酯膜并發生遷移，同時通過在Transwell的上室鋪上Matrigel膠來模擬ECM，從而達到模擬侵襲的目的。Matrigel是從EHS小鼠肉瘤得到的可溶性的基底膜類似物，此種肉瘤富含ECM蛋白，有利于在體外研究細胞侵染的過程[10]。

Fig 4　Expression of MMP-2 in each group(n=3)

A: The expression of MMP-2; B: The expression bar graph of MMP-2. 1-6: Groups treated by compounds 1～6; 7: Blank control; 8:TSAHC.*P<0.05vsblank group

Fig 5　Molecular docking graph of compound 2(A), 3 (B) and TSAHC(C)

隨后我們在蛋白水平上，針對降解ECM的核心MMPs進行了評價。MMPs是一類金屬離子Zn依賴的蛋白水解酶超家族，主要功能為降解多種ECM成分[11]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中研究較為透徹的兩個因子，其表達量的多少與ECM的數量息息相關[12]。MMP-2廣泛存在于細胞和組織之中。研究顯示，MMP-2的含量長期處于一個動態平衡，主要受到ERK/MAPK和JAK-STAT信號通路的調控[13]。其在酶解ECM Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用[14]，且通過Western blot實驗發現，所得到的化合物2、3可以有效抑制MMP-2蛋白的表達，而其他化合物對于MMP-2蛋白的抑制作用較有限，提示化合物2、3的抗腫瘤侵襲作用應該是通過干擾MMP-2表達而實現的，且可以達到陽性對照TSAHC的效果。但化合物是直接作用于MMP-2靶蛋白，還是作用于上下游信號通路則需進一步研究。分子對接結果顯示，化合物2與MMP-2形成了2根氫鍵，而化合物3與目標蛋白則形成了4根氫鍵，多出的兩根氫鍵為磺酰基的貢獻。結果顯示，查耳酮結構右側的間位酚羥基對于MMP-2靶點而言是必需的。磺酰胺鍵和酰胺鍵對于整個化合物的得分具有正效應。先導化合物TSAHC的羰基端為一甲苯結構，在本項目中被置換為噻吩結構，在噻吩中雜原子的電負性和分散正電荷的能力較苯要強許多，且雜五元環的芳香性較苯而言要小。因此，被認為更可能與氨基酸殘基形成氫鍵，或者引發拉電子效應，強化旁邊磺酰胺的氫鍵強度，形成更好的靶點效應，得分也更高。

綜上所述，本研究基于天然產物衍生的大方向而展開，基于先導化合物TSAHC，豐富了該化合物構效關系研究。以噻吩為衍生基團，得到了6個新的近羰基端延長的新的查耳酮類化合物，通過MTT實驗得出了初步的抗增殖結果。通過體外腫瘤侵襲實驗，篩選得到了具有抑制腫瘤侵襲的兩個化合物2、3，并采用Western blot法對腫瘤侵襲中的核心蛋白MMP-2做了表達評估，結合分子對接，初步結果闡明了目的化合物與MMP-2蛋白之間的構效關系，豐富了TSAHC系列化合物的研究。

(致謝：本實驗化學合成部分完成于武漢工程大學化工與制藥學院，活性評價部分完成于鄭州大學第一附屬醫院藥學部。感謝武漢工程大學碩士研究生王國祥，鄭大一附院藥學部研究生吳煒、陳琪等同學的工作。)

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Tumorinvasioninhibitionofthiophenesubstitutedlongchainchalcones

ZHAO Song-feng1, ZHANG Heng2, WEI Han1, LIU Zhi-mei3, ZHANG Xiao-jian1, LIU Zi-wei2